Peran penting EZH2 dan EHMT1 dalam embrio pria Fenacockas Solenopsis
Father Genome Removal (PGE) adalah strategi reproduksi yang tidak dipahami dengan baik, meskipun wanita biasanya dua kali lipat, tetapi lak i-laki kehilangan genom ayah. Father Genome Hetero Chromatin (PGH) terjadi dalam bola ovarium dengan PGE Seri Sel Kuman seperti Euglena, Coffee Noki Ebey, dan Book Rice. Di sini, di Phenacoccus solenopsis Tinsley, PGH adalah bukti bahwa PGH pertama kali terjadi selama embrio awal sekitar 15 & amp;#8201; Analisis transkriptome dan verifikasi qPCR menunjukkan bahwa enam gen histon lisin methyltransferase (KMT) terutama diekspresikan pada orang dewasa. Kelima gen ini dirobohkan oleh dsRN A-micr o-diansi. Akibatnya, regulasi dua gen KMT, psezh2-x1 dan psehmt1 telah mengurangi metilasi terkait heterokilomatin, termasuk H3K27Me1, H3K27Me3, dan H3K9Me3 dalam ovarium, mengurangi embrio PGH, yang mengurangi lekah. Untuk konfirmasi lebih lanjut, kami memperoleh dua sistem, tabako transgenik yang sangat diekspresikan dsRNA, yang masing-masing menjadi target. Demikian pula, ketika transgenik dan rokok ini dimakan, penurunan embrio PGH dan penurunan keturunan pria diamati. Secara keseluruhan, kami menyajikan bukti bahwa Psezh2-X1 dan Psehmt1 mengendalikan pembentukan PGH dari Watakai Garambushi, yang memiliki peran penting dalam kelangsungan hidup embrio pria. RNAI AGA Tentang Peran Histon Lizinmethylated Enzyme EZH2 dan EHMT1 dalam embrio jantan Watakai
Phenacoccus solenopsis の 雄性 胚 発生 における ヒストン リジン メチル 化 酵素 Ezh2 と Ehmt1 の 重要 な 役 割 フェナコッカス ・ ソレノプシス の 胚 発生 における ヒストン メチル 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素 酵素
Peran penting EZH2 dan EHMT1 dalam embrio pria Fenacockas Solenopsis
Father Genome Removal (PGE) adalah strategi reproduksi yang tidak dipahami dengan baik, meskipun wanita biasanya dua kali lipat, tetapi lak i-laki kehilangan genom ayah. Father Genome Hetero Chromatin (PGH) terjadi dalam bola ovarium dengan serial sel kuman seperti Euglena, Coffee Noki Ebey, dan Book Rice. Di sini, di Phenacoccus solenopsis Tinsley, PGH adalah bukti bahwa PGH pertama kali terjadi selama embrio awal sekitar 15 & amp;#8201; Analisis transkriptome dan verifikasi qPCR menunjukkan bahwa enam gen histon lisin methyltransferase (KMT) terutama diekspresikan pada orang dewasa. Kelima gen ini dirobohkan oleh dsRN A-micr o-diansi. Akibatnya, regulasi dua gen KMT, psezh2-x1 dan psehmt1 telah mengurangi metilasi terkait heterokilomatin, termasuk H3K27Me1, H3K27Me3, dan H3K9Me3 dalam ovarium, mengurangi embrio PGH, yang mengurangi lekah. Untuk konfirmasi lebih lanjut, kami memperoleh dua sistem, tabako transgenik yang sangat diekspresikan dsRNA, yang masing-masing menjadi target. Demikian pula, ketika transgenik dan rokok ini dimakan, penurunan embrio PGH dan penurunan keturunan pria diamati. Secara keseluruhan, kami menyajikan bukti bahwa Psezh2-X1 dan Psehmt1 mengendalikan pembentukan PGH dari Watakai Garambushi, yang memiliki peran penting dalam kelangsungan hidup embrio pria. RNAI AGA Tentang Peran Histon Lizinmethylated Enzyme EZH2 dan EHMT1 dalam embrio jantan Watakai
Peran penting enzim Phenacoccus solenopsis janta n-lysi n-Lysi n-metilasi EZH2 dan EHMT1
Father Genome Removal (PGE) adalah strategi reproduksi yang tidak dipahami dengan baik, meskipun wanita biasanya dua kali lipat, tetapi lak i-laki kehilangan genom ayah. Father Genome Hetero Chromatin (PGH) terjadi dalam bola ovarium dengan serial sel kuman seperti Euglena, Coffee Noki Ebey, dan Book Rice. Di sini, ini menunjukkan bukti bahwa PGH pertama kali terjadi selama kejadian embrio awal 15 jam (HPM) setelah kawin Watakai Garamushi Phenacoccus solenopsis Tinsley. Analisis transkriptome dan verifikasi qPCR menunjukkan bahwa enam gen histon lisin methyltransferase (KMT) terutama diekspresikan pada orang dewasa. Kelima gen ini dirobohkan oleh dsRN A-micr o-diansi. Akibatnya, knock-down antara dua gen KMT, psezh2-x1 dan psehmt1, mengurangi metilasi terkait heterokomatin seperti H3K27Me1, H3K27Me3, dan H3K9me3 dalam ovarium, mengurangi embrio PGH. Untuk konfirmasi lebih lanjut, kami memperoleh dua sistem: Tabaco transgenik, yang masing-masing sangat diekspresikan dsRNA, psezh2-x1 dan psehmt1. Demikian pula, ketika tanaman transgenik dan rokok ini dimakan, penurunan embrio PGH dan penurunan keturunan pria diamati. Secara keseluruhan, kami menyajikan bukti bahwa psezh2-x1 dan psehmt1 mengontrol pembentukan pgh galam watakai, yang sangat diperlukan untuk kelangsungan hidup embrio pria.
Father Genome Removal (PGE) adalah strategi reproduksi yang menarik yang terjadi baik jantan dan betina dari telur yang dibuahi. Namun, pada pria, semua kromosom ayah dihilangkan pada tahap pengembangan embrio dan pembentukan sperma, dan hanya tipe Huh Pro yang diwarisi dari ibu yang diwarisi ke generasi berikutnya 1, 2, 3, 4. PGE dilaporkan setidaknya ketujuh dari arthropoda, di mana lebih dari 20. 000 spesies, termasuk parasit, Simphe Plaona, Haningai, Fushigidane Eye, Wing Sae, Bipolai, dan Liposelis Bookris Eye. PGE memiliki dua kelas: embrio PGE terutama ditemukan pada tungau dan serangga kuku kusta, dan genom ayah jantan dihilangkan di awal embrio, dan haploid terjadi pada tahap kehidupan 8 yang tersisa; PGE, kromosom ayah dihilangkan selama pembentukan kuman, tetapi ada dalam jaringan individu. 3, 9).
Di Mary, genom ayah pria menghilang selama pembentukan sperma, tetapi dipelihara di sebagian besar tahap, seperti kutu kopi 10 dan memesan nasi 7. Heterocyatin genom ayah (PGH) adalah tipe nuklir 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, modifikasi epigenetik 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 26, 26, 27, 28, 29, 30, pencetakan genomik 2. 31, 32, 33, 34, 35 tentang distribusi seksual, telah menarik banyak perhatian. PGH Planocokas Citri pertama kali diamati dalam kista tepi potret, yaitu, perpecahan ke-7 dari embrio, dan periode nuklir 128-256 pertama. Sampai saat ini, beberapa penanda terpenting yang terkait dengan PGH dilaporkan menjadi 21, 22, 27, 32, 37, yang telah dilaporkan pada beberapa peristiwa histone, termasuk H3K9me2, H3K9me3, H4K20Me3, dan H3K27Me3. Di antara mereka, H3K9me3 dan H4K20Me3 telah secara fungsional terbukti terlibat dalam pembentukan PGH di P. Namun, dampak metilasi Histon pada pengembangan embrio pria PGH belum dijelaskan.
Histon Lizin Methyltrance Ferase (KMT) adalah 39, 40, yang sering dipertahankan untuk mengendalikan metilasi histone dalam tubuh yang hidup. Hampir semua Histon KMT, yang dapat dimetilasi H3K9, H3K27, dan H4K20, memiliki set yang disimpan (SU (VAR) 3-9, penambah-Zeste, Trithorax) domain. Misalnya, EZH2 (penambah zeste homolog 2) mempengaruhi H3K27, dan juga disebut EHMT1 (histone-lisin eakromatik N-metiltransferase 1, protein seperti G9A 1 (GLP)). Hilangnya fungsi KMT dipelajari dengan baik pada mamalia, dan dikenal karena kelainan embrio awalnya, 45, 46, 47, heterogen 48, dan 49, 50, 51 embrio. Di Euglena, KMT terkait dengan tiga H3K9 dan H4K20 dari H4K20, HMT4-20 (juga disebut SUV4-20), SUV39, dan Set-DB1, adalah kromatin heterosit dari kromosom pater P. citri melalui RNAi.
Watakai Garamushi Phenacoccus solenopsis Tinsley (Hemiptera) adalah hama yang merupakan hama yang telah menginvasi Asia dan berbagai bagian dunia. P. solenopsis telah diamati sebagai embrio telur, memiliki periode sekitar 12 hari (rat a-rata), dan memungkinkan embrio tumbuh dalam tubuh wanita hamil. Telur diletakkan di kantung telur selama periode pemijahan, dan 54, yang menetas hingga usia dalam waktu singkat (dalam satu hari). Di sisi lain, embrio tumbuh di tubuh ibu, dan semua telur bertelur dalam dua hingga empat kantung telur. Kami sebelumnya telah mengidentifikasi PGH jantan dari Wata Aerushi, yang menunjukkan bahwa dua peristiwa metilasi histon, H3K9me3 dan H3K27Me3, terkonsentrasi dengan embrio PGH jantan. Untuk lebih mengevaluasi peran histon KMT dalam embrio, penampilan embrio PGH betina dari wanita yang hamil pada berbagai waktu setelah persimpangan terdeteksi menggunakan pewarnaan DAPI. Mengetuk dua Histon KMT, Psezh2-X1 dan Psehmt1, menggunakan injeksi dsRNA atau rokok transgenik yang mengekspresikan dsRNA saya mendapat bukti bahwa itu.0Embrio PGH adalah 27, 32, 33, 34, 56 (Gambar 1A-D), yang ditakdirkan untuk tumbuh menjadi jantan dengan genom ayah kental yang terdeteksi oleh kumbang kapas. Namun, tidak diketahui kapan embrio PGH akan muncul di ovarium dewasa karena Wataba adalah janin telur. Oleh karena itu, 96 ovarium dari 96 serangga betina, yang tidak dikawinkan dengan 1071 serangga betina kawin 12-43 jam (hpm) setelah kawin, dibedah, dan pewarnaan DAPI diidentifikasi dengan pewarnaan DAPI. Akibatnya, embrio PGH pertama kali diamati pada 15 hpm pada ovarium betina. Di sisi lain, embrio PGH tidak terdeteksi pada wanita sebelum 15 hpm dan betina kawin (Gbr. 1E-F dan Gambar Tambahan 1). Jumlah semua embrio dan embrio PGH meningkat secara signifikan dengan waktu setelah kawin (Gambar Tambahan 2). Embrio PGH hanya muncul pada 3 % wanita pada 15 hpms, tetapi semuanya ada di semua wanita pada 40 hpm (Gbr. 1E). Menariknya, rasio embrio PGH terhadap seluruh embrio menunjukkan variasi besar 8, 3 % hingga 75, 0 % (Gbr. 1F), menunjukkan bahwa jumlah keturunan pria berbeda untuk wanita.0Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa H3K9me3 dan H3K27me3 memiliki peran dalam mempertahankan PGH Garamushi Watakai jantan. Karena embrio PGH diidentifikasi dalam ovarium betina, dalam pembentukan PGH dalam pengembangan embrio awal, mereka mengusulkan peran gen KMT, yang dapat mengkatalisasi modifikasi epigenetik ini. Untuk mengidentifikasi KMT, yang dapat berfungsi untuk pembentukan PGH dalam pengembangan embrio awal, daripada mempertahankan PGH jantan, membandingkan silan g-scriptome dari wanita yang dilintasi dan transkriptom pria dari pria dewasa (Suplemen 1 dan Suplemen) ). , Tabel Tambahan 2, dan Data Tambahan 1). 3, Tabel Tambahan 2, Data Tambahan 1).
Enam gen kmt ini diamplifikasi (Tabel Tambahan 3, Nomor Akses GenBank: OR259393-OR259398), yang semuanya termasuk domain set yang disimpan (Gambar 4). Kecuali untuk PSPR-SET7, yang sangat diekspresikan dalam pupa, lima gen kmt lainnya, pseggle, psezh2-x1, pssuv39h2, psehmt1, dan psezh2-x2 terutama diekspresikan pada orang dewasa (Gbr. 2a 2a., B dan figur tambahan adalah figur tambahan adalah figur tambahan (Gbr. 2A 2A., B dan B dan Tambahan adalah figur tambahan adalah figur Tambahan (Gbr. 2A 2A., 6) menyarankan bahwa ia memainkan peran penting dalam menetapkan heterokromatin dalam ovarium. Semua enam gen KMT semuanya sangat diekspresikan dalam ovarium betina, dan PSSUV39H2 dan PSPR-SET7 sangat diekspresikan dalam lemak (Gambar 2C, D dan Gambar Tambahan 7). Secara keseluruhan, itu menyarankan bahwa setidaknya lima gen kmt, termasuk pseggless, psezh2-x1, pssuv39h2, psehmt1, dan psezh2-x2, dapat memainkan peran penting dalam ovarium tubuh wanita.
Setelah itu, lima kmt merobohkan dsRNA yang ditargetkan oleh masin g-masing gen oleh bug mikr o-gated tiga hari kemudian. Jumlah ekspresi masing-masing KMT dikurangi menjadi 45, 6-65, 4%menjadi 60 jam setelah mikro-ingrade dsRNA (setara dengan 48 jam, Gambar tambahan 8). Geulasi mikroin dsRNA 60 jam kemudian, ovarium betina dibedah. Pewarnaan DAPI menunjukkan bahwa jumlah total embrio tidak berubah pada seluruh kelompok dsRNA, dan bahkan jika kelima kmt ini dirobohkan, dampaknya pada pengembangan embrio terbatas ((). Gambar 3A dan Tambahan Gambar 9). Namun, ketika ekspresi psezh2-x1 (GLM oleh poisson, p = 3, 33E-6) dan psehmt1 (GLM, p = 0, 009) ditekan, embrio PGH telah berkurang secara signifikan (Gbr. 3B, C), DS. GLM dengan Poisson, P = 0, 081), DS PSSUV39H2 (GLM dengan Poisson, P = 0, 854), DS Psezh2-X2 (GLM dengan Poisson, P = 0, 122). Hasil ini menunjukkan bahwa psezh2-x1 dan psehmt1 memainkan peran penting dalam mengendalikan jumlah embrio PGH.
Selanjutnya, kami memeriksa jenis heterokromatin apa yang terkait dengan metilasi histon dikendalikan oleh psezh2-x1 dan psehmt1 di wataba. 40, 42 telah dilaporkan bahwa metilasi H3K9, H3K27, dan H4K20 terutama terkait dengan pembentukan heterokromatin. Karena H4K20me1 dan H4K20 ME3 tidak terdeteksi pada pria dan wanita, kami menganalisis metilasi H3K9 dan H3K27. Eksperimen Western blotting menunjukkan bahwa histon H3 (referensi internal) menunjukkan tingkat tingkat yang sama antara kelompok yang berbeda, dan bahwa jumlah sampel yang dimuat dalam setiap kelompok adalah konstan. Di sini, H3K9me3 dan H3K27Me1 sangat ada di ovarium Wataa kamumushi. Dua modifikasi histon ini berkurang secara signifikan oleh knockdown psezh2-x1 dan psehmt1 (Gbr. 3D dan Gambar tambahan 14). Di sisi lain, H3K9me1 tetap pada tingkat rendah di ovarium Wataa kamemushi (Gambar 3D dan Gambar Tambahan 14). Hasil ini menunjukkan bahwa psezh2-x1 dan psehmt1 dapat mengkatalisasi modifikasi H3K9me3 dan H3K27me1, mengendalikan embrio PGH.
Selanjutnya, kami memeriksa pengetahuan geulasi mikro dsRNA menggunakan tanaman tabaco transgenik yang mengekspresikan dsRNA psezh2-x1 dan psehmt1. Rokok transgenik dibangun menggunakan kaset ekspresi dsRNA DS2300-DSRNA vektor (Tambahan Gambar 10A). Menggunakan aggrobacterium, 31 transformator tembakau (trans_ psezh2-x1) dan 36 transformator tembakau (trans_ psehmt1) dibuat (generasi t).
) (Tambahan Gambar 10b). Dari ini, 15 individu dan 13 t
Tanaman tembakau 15 dan 13 yang dimodifikasi secara genetik (GM) dipilih dari grup Transformer_ Psezh2-X1 dan grup transformator _ psehmt1. Ketika tingkat ekspresi dsRNA dari tanaman ini dievaluasi oleh qPCR, kelompok trans_ psezh2-psezh2-grup#1 dan trans_ psehmt1 adalah tingkat ekspresi dsRNA tertinggi (Gambar 10C, D). Kedua sistem ini digunakan untuk kerusakan makanan Watakyushi, dan saya merobohkan Psezh2-X1 dan psehmt1.
Efisiensi RNAi dari rokok modifikasi gen diperiksa menggunakan qPCR. Akibatnya, ekspresi psezh2-x1 dan psehmt1 berhasil menurun baik dalam ovarium pada hari ke-6 (48 jam pm) setelah pakan tembakau GM, dan dalam kelompok psezh2-x1 52. 1 ± 5, 4 % (siswa-t-testest-t trans_ psezh2-1 , P = 0, 008), kelompok Trans_ Psehmt1 turun menjadi 53, 8 ± 4, 6 % (uj i-t Student, p = 0, 004) (Gambar Tambahan 10e).
Dengan menggunakan sistem rokok yang dimodifikasi secara genetik ini, jumlah embrio ovarium yang dipisahkan dari metilasi betina dan histon diperiksa 48 jam setelah 48 jam (6 hari setelah pakan tembakau). Dibandingkan dengan kelompok pemberian makan tembakau WT, kelompok Wataba dalam transformator _ psezh2-x1 tembakau (GLM, p = 0, 140 oleh porson) dan transformer_psehmt1 tembakau (GLM, p = 0, 051). Gbr. 4a). Namun, rasio embrio PGH (trans_psezh2-x1: glm dengan poisson, p = 6. 04e-7; trans_ psehmt1: glm dengan poisson, p = 9. 72e-8) dan embrio pgh telah berkurang secara signifikan (trans_psezh 2-x1: Glm dengan Binomial, p = 9. 69e-3; Selain itu, merobohkan PsezH2-X1 berkurang secara signifikan antara H3K27me1 dan H3K27me3, dan merobohkan PsehMT1 mengurangi tingkat H3K9me3 (Gambar 4D dan Gambar Tambahan 14).
Untuk menyelidiki lebih lanjut perubahan dalam jumlah hama di berbagai fase pemijahan perempuan Konaga, setiap wanita diselidiki setiap hari. Dalam 15 hari setelah pemijahan (panjang maksimum semua serangga yang diamati), trans_ psezh2-x1 dan trans_ psehmt1 kelompok umpan memiliki rasio lebih rendah dari pria, total parlemen, dan pria. Namun, tidak ada perbedaan yang jelas antara WT dan rokok yang dimodifikasi secara genetik pada sebagian besar hari pemijahan anak-anak perempuan (Gambar 4I-L). Hasil ini lebih lanjut memverifikasi bahwa psezh2-x1 dan psehmt1 memainkan peran penting dalam kejadian laki-laki dengan mengendalikan metilasi histon di wataab.
Karena Schrader 57 melaporkan PGE untuk pertama kalinya di Suss Cockas Nipae (Pseudococcus nipae), karakteristik sistem ini telah dicatat pada berbagai hewan tiram. Namun, mekanisme molekuler, yang merupakan fondasi PGE, masih belum diketahui. Dalam penelitian ini, dua gen kMT konsentrasi serangga betina, psezh2-x1 dan psehmt1, dan mengendalikan metilasi di atas H3K9 dan H3K27, berkontribusi pada terjadinya PGH, mengurangi jumlah embrio PGH dan pria. dalam rasio keturunan. Sejauh yang kita ketahui, ini adalah laporan pertama yang telah mengungkapkan fungsi penting KMT pada spesies kelangsungan hidup embrio jantan yang pgeed.
Beberapa spesies menunjukkan embrio telur, dan embrio adalah 58, 59, 60, yang tumbuh dalam tubuh serangga betina. Dalam kasus P. citri, telur hampir 38 dalam periode pembentukan lambung, dan PGH dilaporkan disebabkan oleh divisi ketujuh dari satu embrio. Di sisi lain, serangga Wayatoga adalah embrio telur, dan betina dewasa diletakkan siap untuk menetas telur, dan tidak diketahui tentang pembentukan PGH pada embrio dan tingkat individu. Dalam penelitian ini, terjadinya embrio PGH pada tingkat individu ditarik secara komprehensif. Di Watamabu, embrio PGH dapat dibedakan dengan pewarnaan DAPI 15 hpm (Gbr. 1E). Ini berarti bahwa faktor penyesuaian dalam pembentukan PGH embrio awal di Watamabu harus dilakukan pada ja m-jam berikutnya.
Menurut penelitian, embrio PGH diusulkan sebagai lak i-laki. Meskipun kami tidak mengkonfirmasi dengan hat i-hati di sini, korelasi antara produksi pria dan embrio PGH dapat berupa informasi yang diperoleh dari percobaan pemrosesan rokok, di mana jantan (Gbr. 4i) dan embrio PGH (Gambar 4B) yang diproduksi pada har i-hari awal sejauh ini. Dalam penelitian ini, rasio gender dalam jumlah pemijahan per hari (nilai rata-rata pria, nilai rata-rata 0, 4-0, 5) relatif stabil (Gambar 4I-L), dan ibu dari distribusi seksual di Wataab ditunjukkan bahwa hampir tidak ada usia. Hasil ini sedikit berbeda dari P. citri, dan betina melahirkan banyak anak pada har i-hari awal pemijahan hari. Selain itu, setidaknya dalam tomat (kelompok pemrosesan DS GFP, Gambar 3H) dan tembakau (kelompok pemrosesan WT, Gambar 4H), efek tanaman Tuhan pada rasio gender jarang ditemukan, dan berbeda dari kelompok Watarabs lainnya . 61, 62. Variasi dalam jumlah serangga individu betina mungkin terkait dengan perbedaan anta r-individu, seperti dalam pengamatan kami sebelumnya mengenai parameter pemuliaan semacam ini. Singkatnya, kami memberikan bukti awal untuk diskusi tentang dampak kondisi lingkungan pada jumlah umpan balik pria dan rasio pria dan wanita. Faktor lingkungan terperinci (kemacetan, usia wanita, suhu, pengalaman kawin, dll.) Dan sistem genetik layak diselidiki lebih lanjut.
Metilasi H3K9, H3K27, dan H4K20 adalah penanda umum yang terkait dengan heterokromatinisasi. Di Meriamushi, H3K9me2, H3K9me3, H3K27Me3, dan H4K20Me3 ditemukan di 21, 22, 32, 36, 38, 64 dengan jaringan pria dan embrio. Di Watard, H3K9me3 dan H3K27Me3 terkonsentrasi pada pria, tetapi dalam jenis ini, H4K20 tidak terdeteksi pada tipe 27 ini. Kami lebih lanjut mengidentifikasi monometilasi, dimetilasi H3K27, dan dimetilasi H3K27 dalam embrio Wataa kokumushi (Gbr. 3D dan 4D, Gambar Tambahan 14), yang menunjukkan fungsi yang dianggap terlibat dalam pembentukan PGH. 2, 31, 32, serta Kaigaramushi lainnya, perlu mencari tahu apakah metilasi histon ini berfungsi sebagai produsen pencetakan genom dalam proses perubahan generasi Wataa kamemushi. Dalam penelitian
Pada embrio awal mamalia, fungsi spesies sistem reproduksi PGE masih belum diketahui, dengan 42 terkait dengan pembentukan heterokromatin dengan mengendalikan beberapa KMT ke metilasi histon spesifik. Tidak seperti penelitian terbaru 38, yang menampilkan hampir semua gen histon metil transferase yang terkait dengan H3K9 dan H4K20 Citri, kami menggunakan analisis transkriptome di sini. Daripada mempertahankan PGH jantan, fokusnya adalah pada KMT, yang dapat terlibat dalam pembentukan PGH pada tahap awal embrio, jadi kami menjerit enam gen kmt, sangat diekspresikan pada betina kawin. Akhirnya, dengan ekspresi profil dan analisis fungsional berbasis RNAi, kami berhasil mengidentifikasi gen KMT yang terkonsentrasi pada dua badan betina, psezh2-x1 dan psehmt1 (Gbr. 3a 3a). Baik psezh2-x1 dan psehmt1 berisi domain set yang disimpan (Gambar 4), psezh2-x1 berfungsi dengan membentuk H3K27Me1 dan H3K27me3, dan psehmt1 mempengaruhi produksi H3K9me3 (Gambar 3d. Dan 4d, Gambar Tambahan 14). Ini sama dengan struktur dan fungsi EZH2 65, 66 dan EHMT1 49, 67, 68 pada mamalia. Hasil ini mengungkapkan konservasi fungsional KMT. Dua fungsi KMT ini tidak diperiksa untuk 27 dan jenis metilasi histon lainnya, karena metilasi pada H4K20 tidak terdeteksi antara jantan dan jantan dari WiraGaramushi. Dalam beberapa KMT lainnya, pada embrio awal mamalia
KMT mengontrol berbagai jenis ekspresi pada tahap mamalia, terutama pada tahap embrio. P. citri memiliki jumlah embrio PGH yang dikurangi ketika HMT4-20 PC1/2, SU (VAR) 3-9 PC3/4, dan setDB1PC1. Jenis ekspresi yang serupa terdeteksi ketika merobohkan psezh2-x1 atau psehmt1 dengan kumbang airide. Selain itu, knock-down masing-masing gen diamati, tetapi ini terutama karena penurunan jumlah anak laki-laki, dan jarang terlihat (Gbr. 3e-) (Gbr. 3e-). 4e-l), dua kmt, efek metilasi histon pada generasi betina. Ketika dikombinasikan dengan peran pembentukan embrio PGH (pria) dan perubahan jumlah keturunan, psezh2-x1 dan psehmt1 jelas berfungsi di wataba, bukan wanita, tetapi memiliki pgh. KMT dalam spesies. Hasil ini berbeda dari pengetahuan bahwa perubahan dalam modifikasi histon menyebabkan perubahan gender embrio dalam reptil. Pada embrio pria, merobohkan psezh2-x1 dan psehmt1 dapat menyebabkan embrio mati, seperti beberapa mamalia. Di sisi lain, jumlah embrio PGH menurun, tetapi penurunan signifikan dalam seluruh embrio tidak terdeteksi (Gbr. 3a, b dan 4a, b), sehingga celah tidak bertahan sampai pembentukan heterokromatin yang khas .RNAi adalah 70, 71, 72 banyak digunakan sebagai alat yang berharga untuk mempelajari fungsi gen Mary. Dalam penelitian ini, mikro dsRNA berhasil dalam knoc k-down dari lima jenis KMT, menentukan bahwa dua jenis KMT, Psezh2 dan Psehmt1, terlibat dalam pembentukan PGH. Efisiensi knoc k-down psezh2 dan psehmt1 menunjukkan sedikit penurunan antara 12 hpm dan 24 hpm, tetapi tidak signifikan (Gbr. 12). Kami juga menangkap dsRNA dalam rokok rekombinan genetik dan merobohkan kedua gen ini dalam strategi berdasarkan makan. Kedua metode menunjukkan perubahan jenis ekspresi serta penelitian kami sebelumnya 72 tentang penelitian kami sebelumnya 72 tentang gen reduksi asyl-CoA fat-co (PSFAR) gen. Karena cedera karena suntikan, kelompok mikr o-i n-i n-dsRNA telah secara signifikan mengurangi umurnya (Gambar tambahan 11) dan jumlah keturunan dibandingkan dengan kelompok pemberian makan rokok yang dimodifikasi secara genetik. Menurut pengamatan kami menggunakan metode ini, 72, bahkan jika orang dewasa diubah dari tomat (inang asli di lab) menjadi rokok, ada sedikit efek pada kelangsungan hidup orang dewasa, sehingga kepala Wataa Brambushi. . Di masa depan, metode berikut menggunakan RNAi dapat dipelajari.Secara keseluruhan, terjadinya embrio PGH di galam Watakai secara komprehensif diatasi pada tingkat individu. Dengan menggunakan dua pendekatan RNAi, kami berhasil mengidentifikasi dua gen KMT, Psezh2-X1 dan Psehmt1, yang memainkan peran penting dalam pembentukan PGH jantan. Pengetahuan ini membantu memahami fungsi KMT yang mengontrol generasi lak i-laki dengan sistem genetik PGE.< 0.05.
P. solenopsis, yang digunakan dalam penelitian ini, pada awalnya diperoleh dari Kinka, Cina pada tahun 2016. Serangga ditanam pada tanaman tomat segar (sistem: hezuo-903) dalam suhu 27 ± 1 ° C, kelembaban relatif 75 %, siklus cahaya 14 jam, dan ruang kontrol iklim gelap 10 jam. Rincian pertumbuhan serangga dan cara menumbuhkan stok tomat diuraikan dalam huruf 63. 63.
Dapi diwarnai untuk mengamati PGH pada jaringan pria atau embrio. Secara khusus, serangga yang dikumpulkan ditetapkan pada 4 ° C selama 24 jam menggunakan solusi Carnoy (#G2312, Solarbio). Jaringan perut dipisahkan dari serangga dalam 1 x bantalan festa fosfor yang disterilkan dengan saline fana (PBS, pH7. 4) dan dimasukkan ke dalam larutan DAPI (#9564, Sigma). Setelah pewarnaan DAPI 30 menit dalam kegelapan dan suhu kamar, jaringan dipasang pada slide dan diamati dengan mikroskop fokus laser (LSM780, Carl Zeiss).
Dalam penelitian ini, pisau bedah dewasa baru digunakan untuk menguji jumlah embrio PGH betina. Wanita dewasa pada hari ketiga kelahiran dilintasi dengan pria yang sehat. Saya mengumpulkan wanita setiap jam hingga pukul 12:00 dan 43 sore. Setidaknya 30 wanita diperoleh setiap kali. Setelah pewarnaan DAPI, embrio dikuantifikasi berdasarkan kriteria berikut: (1) Hanya embrio dari sisi kaca penutup yang dihitung; Jumlah semua embrio dan embrio pria dari setiap wanita dihitung. Rasio embrio pria untuk setiap wanita dihitung dengan jumlah embrio pria dan semua embrio.
Sebanyak 150 serangga jantan dan 50 serangga betina (sampel kehamilan campuran) dikompilasi menjadi satu sampel, dan sekuensing transkriptome dilakukan. Setiap percobaan urutan dilakukan dalam tiga kereta berturu t-turut. MRNA dimurnikan dari semua RNA dengan mani k-manik magnetik oligo (DT), dan mRNA terfragmentasi dibalik ke cDNA menggunakan primer acak. Perpustakaan diselesaikan hingga akhir, A-Tailing, ligasi adaptor, pemilihan ukuran, amplifikasi, dan pemurnian. Perpustakaan pasangan dibangun menggunakan RNA-seq Lib Prep Kit V2 yang cepat (Cat. RK20306, Abclonal, Wuhan, Cina). Kuantitasnya adalah QUBIT dan PCR real-time, dan perpustakaan dikelola menggunakan Bio Analyzer untuk deteksi distribusi ukuran, dan kemudian sekuensial dilakukan pada platform Illumina Hiseq X Ten di Novoggene (Beijing). Setelah kontrol kualitas, enam data RNA-seq bersih dari perpustakaan diselaraskan sebagai genom P. solenopsis (http://v2. insect-genome. com/organism/624) menggunakan HISAT2 73. Deseq2 74 diidentifikasi ekspresi gen yang berbeda. Ambang batas ekspresi diferensial (DEG) adalah |
Ya.
-nilai
Untuk mendapatkan cDNA KMT yang bena r-benar panjang, penelitian ini menggunakan kit amplifikasi cDNA ras Smart ™ (Takara, Kyoto, Jepang) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara khusus, semua RNA dipisahkan menggunakan reagen Trizol. CDNA ras 5′-UTR dan 3′-UTR disintesis dari total RNA menggunakan primer universal yang melekat pada KMT S dan primer universal yang melekat pada kit. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: 94 ° C selama 3 menit inkubasi; 5 3 menit siklus dalam C; Ekstensi terakhir berlangsung selama 10 menit pada suhu 72 ° C. Produk PCR yang disempurnakan diselesaikan untuk PCLone007 Simple Vector Kit (China, Beijing, Tsingse Biotech), dan urutan dasar ditentukan menggunakan platform Tsingke Biotech Sanger.
Prediksi ORF KMT dilakukan dengan menggunakan NCBI’s Orffinder. Program pintar (Smart. embl-heidelg. de) digunakan untuk mengidentifikasi domain. Penyelarasan beberapa urutan protein KMT dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Clustalx 75. Pohon sistem dibangun menggunakan undan g-undang hukum lingkungan dari program Mega 11. Hubungan lokal ditentukan oleh analisis 1500 pengulangan pengulangan boot. Garis besar organisasi dan nomor akses GenBank yang digunakan di sini ditunjukkan dalam data tambahan 3.
Semua RNA d i-dilarang sesuai dengan protokol pabrikan menggunakan reagen Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Semua 800 ng RNA digunakan untuk sintesis cDNA sesuai dengan instruksi pabrik menggunakan Hiscript III RT Supermix untuk qPCR (+gDNA wiper). RT-PCR kuantitatif adalah semua primer dengan Ariamx Real-Time PCR System (USA). Larutan reaksi 20 μL mengandung 2 μl cDNA, 0, 8 μl, dan 10 μl qPCR Mastermix, diencerkan 10 kali. Reaksi qPCR dilakukan selama 30 detik pada 95 ° C, diikuti oleh 95 ° C selama 10 detik, 60 ° C selama 30 detik. Jumlah RNA dari gen target dinormalisasi oleh psactin mRNA, dan konsentrasi relatif dihitung menggunakan metode 2-ΔCT 77.0/T1Template DNA yang dimurnikan digunakan untuk sintesis dsRNA, dan primer dirancang untuk mengandung promotor T7 RNA polimerase pada akhirnya (Data Tambahan 2). DsRNA adalah kit transkripsi RNA hasil tinggi (vazyme biotech co. Konsentrasi dan kualitas dsRNA) untuk memeriksa kualitas dan ukuran dsRNA. untuk sintesis dsRNA.
Efek mikro P. solenopsis diikuti oleh Eppendorf Injectman Ni 2 Micr o-di Jerman (Eppendorf, Jerman), diikuti oleh Tong dan 72. Sederhananya, serangga betina perawan tiga hari diperlakukan dengan 250 ng dsRNA (250 ng/μl). Setelah injeksi, serangga dibiakkan dalam kotak pemuliaan plastik (panjang 14 cm, lebar 10, 5 cm, tinggi 5 cm) yang berisi satu cabang tomat segar. Caban g-cabang tomat dibungkus dengan kapas lembab untuk memberikan air dan diganti setiap empat hari. Dua belas jam setelah micr o-route, betina ini disilangkan dengan pria yang sehat.0Untuk kelompok administrasi dan kelompok pengendali (DS GFP), 25-30 orang, 48 jam setelah 60 jam (48 jam), 60 jam (48 jam) mikro-ingrade, dikumpulkan. Dari jumlah tersebut, ovarium 6-7 dievaluasi oleh RT-qPCR, dan ovarium 10-15 diwarnai dengan Western blot, dan sisanya adalah DAPI untuk jumlah embrio. Untuk menyelidiki lebih lanjut RNAi tentang kemampuan pemuliaan wanita, ia membuat mikr o-dala m-gasion untuk saudar a-saudaranya sampai ia meninggal setiap tiga hari, dan terus merobohkan gen KMT target sebelum pemijahan dan pemijahan. Semua percobaan dilakukan di tiga stasiun berturu t-turut.1Western blot dilakukan untuk mengidentifikasi pengaruh RNAi pada tingkat metilasi histon ovarium. Secara khusus, 30-40 telur digunakan menggunakan kit ekstraksi protein total minutetm untuk sel dan jaringan yang dikultur hewan. Protein yang terkandung dalam supernatan dikuantifikasi dengan metode BCA (#PC0020, Solarbio, Cina) dan dimodifikasi menggunakan buffer pemuatan SDS-PAGE. Sebanyak 25 μg protein dimuat per jalur per jalur ke gel SDS-PAGE, dan ditransfer ke membran PVDF (#FFP24, Beyotime, Chana). H3K9ME1 (#PTM-643, PTM Biolabs Inc), H3K9Me3 (#13969, Teknologi Pensinyalan Sel, Amerika Serikat), H3K27Me1 (#PTM-5110, PTM Biolabs, China) 2 (#PTM-5010, PTM Biolabs, Tiongkok, Tiongkok) 2 (#PTM-5010, PTM Biolabs, Company, Tiongkok) ), H3K27me3 (#9733, Teknologi Pensinyalan Sel, Amerika Serikat). Histon H3 (#M1309-1, Huabio, Cina) didirikan sebagai referensi internal menurut protokol yang sama. Brot adalah Kit Deteksi Chemiluminescence (#1705041, Bio-Rad Laboratories, USA) dan sistem bio-rad molekuler Chemidoc XRS + yang dibayangkan menggunakan Tories, USA).0Untuk mengekspresikan target dsRNA dengan tembakau, fragmen 416 bp dari psezh2-x1 dan fragmen 424 bp dari psehmt1, primer maju termasuk SMA I dan KPN I yang membatasi bagian, dan primer terbalik termasuk SAC I dan BAM HI Situs Terbatas. Untuk fragmen yang disempurnakan dari masin g-masing KMT, rantai indera dan rantai ant i-sense dicerna menggunakan KPN I + BAM HI dan Sac I + SMA I. Setelah itu, dua rantai pencernaan dimasukkan ke bagian yang sesuai dari vektor ekspresi tanaman (Wuhan Biorun Biosciences), dan dua vektor RNAi yang diubah, yaitu, DS2300-DS Psezh2-X1 1 dibangun. Dua jenis vektor transformasi RNAi dibangun, DS2300-DS PSEZH2-X1 dan DS2300-DS Psehmt1. Setiap vektor diperkenalkan dengan rokok (Nicotiana benthamiana) dengan konversi transformatika aggrova. Transformasi gen rokok adalah Wuhan Biorun Biosciences Co., Ltd.
T positif t
Kit PCR langsung T5 (tanaman) (Tsingse Biotech, Beijing, Cina) digunakan sesuai dengan Tong dan 72 lainnya. Sederhananya, sampel daun rokok dengan diameter 1-2 mm dilarutkan dengan 50 μl buffer A, dan DNA diekstraksi pada 95 ° C selama 10 menit. Selanjutnya, campuran reaksi 50 μL diproduksi menggunakan 1 μl superirtif, 2 μl dari masin g-masing primer, dan 25 μl campuran PCR. Reaksi PCR dilakukan 3 menit pada 95 ° C selama 3 menit, kemudian 98 ° C selama 10 detik, 10 detik pada 63 ° C, selama 15 detik pada 72 ° C, dan 5 menit pada 72 ° C untuk pertumbuhan akhir. RBCL yang direkomendasikan oleh T5 Direct PCR Kit ditetapkan sebagai kontras positif. Semua primer yang digunakan tercantum dalam data tambahan 2. Produk PCR diperiksa dengan renang listrik Agalosgel.
Untuk memilih tanaman GM dengan ekspresi dsRNA tertinggi yang akan digunakan dalam uji bio berikutnya, 15 saham T-tip e-t -cigarette (trans_ psezh2) dan 13 saham T-type tobacco (trans_ psehmt1). RNA daun.
Semua RNA dipuji dari 15 daun (trans_ psezh2) dan 13 daun (trans_ psehmt1), yang dipilih secara acak dari tanaman tembakau GM (50 hari). Menggunakan RT-QPCR, tingkat ekspresi relatif dsRNA pada tanaman tembakau terisolasi diukur. Kami memilih Tobacco EF-1A sebagai kontras internal. Primer diuraikan dalam data tambahan 2. Percobaan dilakukan di tiga stasiun berturu t-turut. T< 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001. SPSS 19, R software, and GraphPad Prism 8.0 were employed for analyses.
Ekspresi dsRNA t tertinggi
Tong, H. J. dkk. Lemak asil-CoA reduktase mempengaruhi biosintesis lilin pada kutu putih kapas, Phenacoccus solenopsis Tinsley Commun
