Osamu Takeuchi, Taro Kawai, Peter F. Mühlradt, Justin D. Radolf, Arturo Zychlinsky, Shizuo, Toll, Identifikasi Protein Lipo Bakteri, Imunitas Internasional SSUE 7, Juli 2001, Halaman 933-940, https://doi. org/ 933-940, https://doi 10. 1093/intimm/13. 7. 933
Navar Search Filter Filter Pencarian Pencarian Seluler Pencarian Input Pencarian Input Pencarian Filter Navi Bar
Lipoprotein bakteri (BLP) menyebabkan respons imun melalui reseptor seperti tol 2 (TLR2), dan karakteristik stimulasi kekebalannya disebabkan oleh adanya n-end yang dikembalikan. Sebagian besar BLP direncanakan oleh residu sistein N-terminal, tetapi mycoplasma dan makrofag diaktifkan lipopeptide-2 KD (MALP-2) hanya diasilisasi. Di sini kami menunjukkan bahwa kami tidak menanggapi sel Malp-2 (TLR6-/-), tetapi mempertahankan reaksi normal terhadap lipopeptida bakteri lainnya. TLR2-/-TLR6-/-Eksperimen Renovasi dalam Fibrobles Kawat Embrio telah mengungkapkan bahwa ko-ekspresi TLR2 dan TLR6 mutlak diperlukan untuk respons MALP-2. Sejalan dengan hasil ini, TLR6 tampaknya bekerja sama dengan TLR2 untuk mengenali MALP-2 dan mengidentifikasi struktur Lipoiled N-terminal MALP-2 dan repeptida bakteri lainnya.
Sistem kekebalan tubuh alami merasakan patogen yang diinfiltrasi (1) oleh reseptor pengenalan pola yang dikodekan dalam seri sel germinal (1). Studi terbaru mengungkapkan bahwa reseptor seperti tol (TLR), homolog (TLR) Shoujo Bais, memainkan peran penting dalam persepsi mikroorganisme (2). TLR adalah reseptor penetrasi tipe I tipe I, memiliki motif leucine ricp ulangi (LRR) di luar sel, dan domain lokal Toll/IL-1R (TIR) dalam sitoplasma, dan mengaktifkan faktor transkripsi NF-κB Diperlukan untuk komunikasi sinyal yang mengarah ke (3). Transisi nuklir NF-κB menginduksi transfer gen sitokin inflamasi, yang mengarah pada pembentukan kekebalan akuisisi. Dari 9 jenis anggota keluarga TLR (3-6), TLR2, TLR4 dan TLR9, terlibat dalam komponen bakteri. TLR2 mengenali peptidoglikan (PGN), berbagai lipopron yang diturunkan mikroorganisme, lipoalavino mannan, dan zimosan (7-14). Sebaliknya, TLR4 dan TLR9 sangat penting untuk reaksi terhadap LIPO poliaccharide (LPS) dan DNA bakteri (15-17). Namun, peran anggota keluarga TLR yang tersisa belum sepenuhnya dijelaskan.
Kami sebelumnya telah melaporkan kloning molekuler TLR6, yang dekat dengan TLR1 dan TLR2. Dalam penelitian ini, TLR6 -/ -Mouse diciptakan oleh penargetan genetik untuk memeriksa fungsi TLR6 in vivo. TLR6-/-Macus makrofag menunjukkan reaksi normal terhadap lipopeptida tri-silasi bakteri lainnya, tetapi pada mikoplasmalipopeptida, yaitu, aktivasi makrofag-2 mycoplasma micha-slasma (MALP-2). Sebaliknya, disarankan bahwa TLR6 bekerja sama dengan TLR2 dalam persepsi MALP-2 dan bertanggung jawab untuk mengidentifikasi ligan TLR2 yang berbeda, karena sel TLR2-/-tidak dapat mengenali jenis lipopeptida apa pun.
Saya mendapat klon genom tikus TLR6 dari perpustakaan genom 129/SV. Sebuah fragmen yang berisi satu eksonson dari klon ini ditaklukkan ke pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) dan ditampilkan oleh pemetaan enzim terbatas dan urutan DNA. Vektor penargetan yang diapit antara gen yang tahan neomisin antara 5 kb dan 3 ‘area genom 5’ area TLR6 dan 1. 1kB. Konstruksi ini dirancang untuk menghilangkan urutan 1, 7kb dari genom TLR6 dari domain ekstraseluler TLR6, domain penetrasi membran, dan bagian dari domain sitoplasma, dan menggantinya dengan gen yang tahan neomisin. Untuk memilih dari rekombinasi non-homolog, kaset HSV-TK diperkenalkan di ujung 5 ‘vektor. Vektor penargetan langsung diperkenalkan ke dalam sel E14. 1 embriogen (ES). Klon yang menunjukkan resisten terhadap G418 dan Gunschlovir disaring untuk rekombinasi homolog dengan PCR, dan analisis brot selatan menggunakan probe yang ditunjukkan pada Gambar. 1 (a) dikonfirmasi. Rekombinasi lokal dikonfirmasi dalam 4 dari 126 klon ES yang tahan terhadap G418 dan Gunschlovir. Klon ES target dibuat menjadi blastokista C57BL/6 untuk membuat mouse chimero. Tikus chimero jantan dilintasi dengan betina C57BL/6 untuk membuat tikus heterosiklik. Setelah itu, tikus ikatan hetero disilangkan untuk mendapatkan balok homo. TLR6 -/ -Mouse dan abdomen tipe liar, yang diperoleh dari perkawinan ini, digunakan untuk percobaan.
Salmonella Minnesota RE59 5-LPS dan PGN yang berasal dari Staphylococcus aureus dibeli dari Sigma (St Louis, MO). MALP-2, Borrelia burgdorferi-turunan lipopeptide (OSPAL dan OSPCL) dan lipopeptide (17L dan 47L) yang berasal dari Treponema pallidum disusun (14, 18, 19). PUM Sintetis3CSK4Diperoleh dari Boehringer Mannheim (Manheim, Jerman). IFN-γ diperoleh dari Genzyme (Cambridge, Massachusetts). TLR2 -/ -Mouse dibuat oleh penargetan genetik seperti yang dijelaskan sebelumnya (7).
Makrofag peritoneum dikumpulkan di media RPMI1640, yang dikumpulkan tiga hari setelah I. P. Tikus embri o-embryo fibroblast (MEF) disiapkan dari embrio pada hari k e-135 dan dikultur dalam 10%mie janin menambahkan DMEM (Life Technologies). Semua percobaan dilakukan pada suksesi 3 dan k e-5.
Konsentrasi faktor nekrotik tumor (TNF) -α dan I L-12 di bagian atas kultur diukur dengan ELISA (Genzyme, Minneapolis, MN). Tidak ada produksi dengan metode Greiss.2/TIDAK3Itu diukur dengan metode Greiss menggunakan uji kit-C (Dojindo, Kumamoto, Jepang).
Makrofag peritoneum (2×16 6) MALP-2 atau PAM3CSK4Saya merangsangnya. Ekstrak nuklir diinkubasi dengan probe spesifik ke situs NF-κB DNA yang bergabung, uji gel shift dilakukan, dan divisualisasikan dengan grafik radio otomatis.
Aktivitas JNK kinase adalah uji seperti yang dijelaskan (20). Sederhananya, MALP-2 atau PAM adalah makrofag peritoneum (1×16) yang diinduksi oleh asam tioglikolat.3CSK4Suded ke sel (20 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, Triton X-100), dan sel-sel dipecahkan, setelah kekebalan pada pelayaran), kami melakukan uji in vitro kinase secara in vitro. Lisensi yang sama dibagi menjadi SDS-PAGE dan ditransfer ke membran nitroselulosa. Membran ini dihapus dengan ant i-JNK1 dan divisualisasikan menggunakan sistem chemiluminescension yang disempurnakan (DuPont, Boston, MA).
TLR6 manusia yang ditandai dengan MYC ke terminal C dibuat dengan metode PCR, dan dicabut ke ekspresi plasmid pef-bos. Bagian membran TLR2 dan sitoplasma (asam amino 584-784) digabungkan ke dalam domain ekstraseluler Fas (asam amino 1-169) dan dikloning ke PEF-BOS. TLR2 dan TLR4 manusia disiapkan oleh PCR dan dikloning ke vektor PCMV-FLAG.
Varian pemotongan C-terminal TLR2 manusia (asam amino 1-643) dan TLR6 (asam amino 1-644) diciptakan oleh PCR. Chimera TLR2/TLR6 dibuat dengan menggabungkan domain ekstraseluler TLR2 (1-583 asam amino 1-583) dengan penetrasi film TLR6 dan sitoplasma (asam amino 578-796). Struktur terbalik, TLR6/TLR2 chimera, dibuat dengan menggabungkan domain ekstraseluler TLR6 (asam amino 1 menjadi 577) ke domain penetrasi film TLR2 dan domain sitoplasma (asam amino 584-784). Vektor PMX/IRES-GFP (PMIG) dibangun dengan memasukkan Polyomovirus IRE dan EGFP ke dalam vektor PMX (21). TLR2, TLR2 Δ, TLR6, TLR6 Δ, TLR2/TLR6 chimera, atau mutan PMIG yang mengandung chimera TLR6/TLR2 dibangun dengan memasukkan setiap cDNA di depan IRE PMIG.
Ginjal embrion manusia 293 sel adalah transformasi sementara sebesar 1, 0 μg PNF-κB Reporter Plasmid (Stratagene), bersama dengan vektor ekspresi yang ditunjukkan oleh Lipofection (Mirus, Madison, WI). Sel-sel dilarutkan 36 jam setelah transfeksi, mengukur aktivitas NF-κB relatif, dan dinormalisasi berdasarkan aktivitas luciferase lautan laut (Promega, Madison, WI).
Stok sel pengemasan Plat-E (22) diubah dengan vektor retrovirus dengan teknologi kehidupan. 48 jam setelah transfeksi, supernatan virus dikumpulkan, dan MEF terinfeksi menggunakan polybulen 10 μg/mL (Sigma). MEF diinkubasi selama 24 jam dengan larutan virus retro, dikultur selama 48 jam dalam media segar, menganalisis fluoresensi protein fluoresen hijau (GFP), dan menguras 3×14 sel yang terinfeksi ke 24 piring sumur. 24 jam kemudian, sel-sel adalah MALP-2 (10 ng/ml) atau PAM3CSK4(100 ng/ml) dirawat selama 18 jam. Konsentrasi IL-6 dalam supernatan diukur dengan ELISA (Endogen, Boston, MA). Efisiensi Transfeksi GFP~40-60%.
Untuk menguji peran fungsional TLR6, penargetan gen dilakukan oleh sel E14. 1 ES, dan TLR6 -/ -Mouse dibuat. Vektor penargetan dirancang untuk menggantikan domain eksternal TLR6, bagian dari domain selogi, dan bagian dari domain sitoplasma dengan gen yang resistan neomisin (Gbr. 1A). Tiga heter o-bergabung dengan sel ES, termasuk gen yang berkonflik TLR6 mutan, berbasis mikro menjadi c57bl/6 blastocysts. Dua dari tikus chimera ini berhasil mentransmisikan gen TLR6 yang hancur melalui seri sel germinal (Gbr. 1B). TLR6 -/ -Mouse dibuat oleh rasio Mendel dari persimpangan antara tikus heterojunition. Tikus itu sehat dan subur dan tidak menunjukkan kelainan yang jelas selama enam bulan pertama. Analisis Northern Blot dilakukan untuk mengkonfirmasi bahwa mutasi TLR6 bena r-benar tidak aktif gen TLR6. MRNA TLR6 tidak terdeteksi oleh makrofag peritoneum dari tikus, dan ekspresi TLR2 tidak berubah antara liar dan TLR6 -/ -Makrofag (Gbr. 1C).
Karena TLR6 diharapkan terlibat dalam pengakuan komponen bakteri, reaksi terhadap jenis mutan TLR6 -/ –Peritoneal makrofag diperiksa pada LPS, PGN, dan oligonukleotida CPG. Tikus liar dan TLR6-/-makrofag peritoneum yang berasal dari tikus dikultur selama 24 jam dengan LPS atau PGN anggur kuning dari berbagai konsentrasi, dan produksi TNF-α diukur. TLR6-/-Makrofag peritoneum dari tikus menanggapi LPS dan menghasilkan TNF-α serta tikus tipe liar (Gbr. 1D). Panduan produksi TNF-α oleh staphylococci PGN sedikit menurun pada makrofag TLR6-/-/-dibandingkan dengan makrofag liar, tetapi masih signifikan (Gambar 1D). Produksi TNF-α yang merespons oligonukleotida dengan motif CPG normal pada makrofag TLR6-/-(tidak ada data yang ditunjukkan).
Lipromer bakteri (BLP) diproduksi oleh banyak spesies patogen bakteri yang berbeda, dan diketahui menginduksi produksi sitokin dalam makrofag (23). Semua lipopron memiliki residu asam amino N-terminal yang dikembalikan, yang sebagian besar adalah sistein gliserik N-Asyl-S-Syasyl (24). Sebaliknya, residu sistein aktivasi makrofag-2kd (MALP-2) yang berasal dari Mycoplasma fermentans hanya S-Giaasil (25). Analog Protein Lipo Sintetis (SBLP), misalnya, Tripalmitoystainyl (PAM)3Cys) lipopeptide Pam3CSK4Diindikasikan bahwa Dipalmit Leaf Malp-2 meniru karakteristik promosi inflamasi BLP (Gbr. 2A) (11, 14). Karena lipopeptida mono-yang tidak dapat memandu produksi TNF-α bahkan pada makrofag tipe liar (data tidak menunjukkan), ditunjukkan bahwa jenis bagian lipid menentukan aktivasi makrofag host. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa pedoman TNF-α dan NO produksi oleh MALP-2 dihambat oleh TLR2-/-makrofag (17). Selain itu, Pam3CSK4Telah dilaporkan secara in vitro bahwa sel mengaktifkan sel melalui TLR2 (11). Kemudian, reaksi sel TLR6-/-/dan TLR2-/-dianalisis untuk lipopeptida sintetis, MALP-2 dan PAM CSK.3CSK4Tipe liar, tlr6-/-dan tlr2-/-makrofag peritoneum dari tikus diobati dengan MALP-2 dengan peningkatan dosis. Sementara makrofag liar mengeluarkan TNF-α sebagai dosis tergantung dosis tergantung-dosis, makrofag TLR2-/-dan TLR6-/-tidak menghasilkan jumlah yang dapat dideteksi dengan menanggapi MALP-2. . Ketika sel-sel diperlakukan dengan MALP-2 dengan IFN-γ, makrofag tipe liar menghasilkan NO dan IL-12, tetapi tidak ada sel TLR2-/-dan TLR6-/-yang menghasilkan jumlah yang dapat dideteksi (tidak satu pun dari mereka). Gambar 2C dan D). Hasil ini menunjukkan bahwa TLR2 dan TLR6 diperlukan untuk produksi sitokin yang diinduksi MALP-2. Selanjutnya, Triple Mito Lipopeptide Pam Sintetis3CSK4Akibatnya, Pam3CSK4Dirangsang produksi TNF-α, NO, IL-12 pada tingkat makrofag liar yang sama dan TLR6-/-/-/-/-makrofag, tetapi makrofag TLR2-/-tidak dapat merangsang produksi (Gbr. 2E-G. )) Selanjutnya, kami memeriksa analog sintetis B. burgdorferi dan T. pallidum lipopeptide (18, 19). Pam3CSK4Produksi TNF-α untuk spirohetto-sex lipopeptida hampir sama dalam makrofag tipe liar dan makrofag TLR6-/-(Gbr. 2H), tetapi respons sel untuk lipopeptida ini telah benar-benar menghilang. Data ini sangat penting bagi TLR2 untuk menghasilkan sitokin sebagai respons terhadap diasilasi dan lipopeptida tr i-silasi, sedangkan TLR6 hanya diperlukan untuk menghasilkan sebagai respons terhadap lipopeptida diaasilasi. Untuk menyelidiki lebih lanjut apakah TLR6 atau TLR2 terlibat dalam pengakuan komponen Mycoplasma, kami memeriksa apakah makrofag mutan ini menanggapi plasma maiko, yang dibunuh oleh panas. TLR6-/-dan TLR2-/-makrofag mengalami penurunan produksi TNF-α untuk mikoplasma yang dibunuh oleh panas dibandingkan dengan sel-sel liar (Gbr. 2i), jadi TLR2 dan TLR6 adalah mycoplasma. peran dalam pengakuan.
BLP terbukti mengaktifkan rute transmisi sinyal NF-κB dan JNK (17, 18). Kami sebelumnya menunjukkan bahwa aktivasi NF-κB dan JNK melalui MALP-2 ditekan oleh TLR2-/-Macrophages (17). Oleh karena itu, kami memeriksa peran TLR6 dalam aktivasi rute transmisi sinyal intraseluler ini. Dalam makrofag tipe liar, aktivitas pengikatan DNA NF-κB diinduksi setelah stimulasi MALP-2, tetapi makrofag TLR6-/-dan TLR2-/-semuanya hilang (Gbr. 3A). Aktivitas NF-κB adalah PAM3CSK4Baik makrofag liar dan TLR6 -/ -Makrofag (Gambar 3B). JNK adalah Pam3CSK4Itu diaktifkan oleh kedua MALP-2, tetapi di makrofag liar3CSK4Itu hanya diaktifkan. Tidak ada lipopeptide yang dapat mengaktifkan JNK dengan TLR2 -/ –Macrophages (Gbr. 3C dan D). Hasil ini membutuhkan TLR2 dan TLR6 untuk transmisi sinyal yang disediakan oleh MALP-2, sedangkan PAM.3CSK4-TLR2 diperlukan untuk menginduksi transmisi sinyal, tetapi TLR6 tidak diperlukan.
In order to find out if the combination of TLR2 and TLR6 plays a specific role in activating intracellular signal transmission cascade, 293 cells of human embryon kidney, TLR4, TLR6 expression vector and NF-κB-dependent Luciferase A transient transformation was made with various combinations reporter plasmid. Menariknya, c o-occurrence TLR2 dan TLR6 telah menyebabkan aktivasi sinergis gen reporter luciferase di ligan yang tidak eksistensi. Sebaliknya, TLR4 tidak menunjukkan efek sinergis pada ekspresi reporter basal ketika dikonversi menjadi TLR2 atau TLR6 (Gbr. 3e). Data ini menunjukkan bahwa TLR2 dan TLR6 dapat bekerja sama secara khusus untuk mengaktifkan kaskade transmisi sinyal. Untuk mengetahui apakah bagian sitogenik TLR2 dan TLR6 terlibat dalam aktivasi NF-κB sinergis, TLR2 (FAS/TLR2) atau TLR6 (FAS/TLR6) Domain membran dan domain sitogen transisi kelebihan struktur chimera yang menggabungkan domain The Domain menjadi 293 sel (14, 23). Ketika struktur chimera ini dibubarkan bersama, gen reporter adalah sinergis (Gbr. 3e), menunjukkan bahwa agregasi domain TLR2 dan TLR6 TR cukup sebagai pemicu kaskade transmisi sinyal.
Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut bahwa TLR6 dan TLR2 diperlukan untuk reaksi MALP-2, kami menyiapkan tipe liar, TLR2-/-, TLR6-/-, TLR2-/-TLR6-/-MEF pertama dari embrio. Pertama dari ini MEFS MALP-2 atau PAM3CSK4Itu diproses untuk mengukur sekresi IL-6 dalam supernatan budaya. Seperti yang diharapkan, MEF tipe liar menghasilkan IL-6 terlepas dari lipopeptide mana, tetapi TLR6-/-MEF tidak dapat menghasilkan IL-6 sebagai respons terhadap MALP-2. Selanjutnya, tlr2 -/ -dan tlr2 -/ -tlr6 -/ -mef tidak menanggapi lipopeptida apa pun (Gbr. 4a).
Selanjutnya, percobaan yang direkonstruksi dilakukan dengan infeksi MEF mutan dengan vektor retrovirus yang mengekspresikan TLR2 manusia, TLR6, bangunan mutan mereka, atau bangunan kontrol (Gbr. 4B). TLR2-/-MEF, yang menginfeksi vektor retrovirus yang mengkodekan TLR2 manusia, adalah MALP-2 dan PAM3CSK4; , ekspresi TLR2 di TLR6 tidak dibalik ke BLP. TLR2 dan C-terminal Cutting TLR6 (TLR6Δ). sel yang terinfeksi bersama dengan TLR2 dan TLR6 (Gbr. 4E).3CSK4Dipulihkan oleh TLR2 saja. Akhirnya, untuk menganalisis basis struktural TLR2 dan TLR6 kerja sama dalam pengenalan ligan dan transmisi sinyal, dua struktur chimera yang menggabungkan domain ekstraseluler TLR2 dan domain penetrasi TLR6 dan domain sitoplasma (TLR2/TLR6 chimera). /TLR2 chimera) diproduksi (Gbr. 4B). Bahkan jika ada protein chimera yang diekspresikan sendiri, malp-2 dan pam3CSK4Tidak mungkin memberikan respons terhadap respons terhadap (Gbr. 4F). Namun, sel-sel yang mengekspresikan kedua protein chimera merespons MALP-2 dan menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam produksi IL-6, tetapi PAM.3CSK4Ini menunjukkan bahwa gabungan domain ekstraseluler TLR2 dan TLR6 dan domain sitoplasma diperlukan untuk pengakuan MALP-2 dan transmisi sinyal (Gambar 4F). Selanjutnya, TLR2 -/ -TLR6 -/ -MEF menunjukkan kedua chimera, tetapi reaksi terhadap Pam CSK tidak pulih.3CSK4Karena reaksi terhadap reaktivitas tidak pulih, TLR lain selain TLR2 juga PAM.3CSK4Menyarankan bahwa perlu untuk dikenali.
Sebuah studi bar u-baru ini tentang keluarga TLR telah mengungkapkan bahwa TLR2 dan TLR4 memainkan peran yang berbeda dalam pengakuan mikroorganisme. Secara khusus, TLR2 menunjukkan bahwa penting untuk pengakuan berbagai macam mikroorganisme seperti PGN, Lipoalavino mannan, lipoprotein, dan zeimosan (7-13). Namun, mekanisme molekuler di mana reseptor ini mengenali berbagai bahan bakteri tidak sepenuhnya dijelaskan. Kami menunjukkan bahwa kombinasi TLR2 dan TLR6 mengenali MALP-2 dan secara khusus membedakan lipopron lainnya. Dalam penelitian sebelumnya, karakteristik imunod o-aktivitas yang kuat dari lipopromino sepenuhnya tergantung pada keberadaan asam lemak pengikat ester pada residu N-terminal (11). Struktur molekul mikoplasma dan BLP berbeda, dan banyak spesies bakteri memiliki satu lipoplaktori dari n-end, dua substituen asam parmitic yang terikat ester, tetapi lipoplastic yang berasal dari mycoplasma adalah kelompok N-asil. , 25). Oleh karena itu, TLR6 tampaknya terlibat dalam identifikasi halus martabat dan residu kebocoran triparmit (Gbr. 5).
Saat ini, tidak ada bukti langsung bahwa TLR mengikat dengan afinitas tinggi dengan masin g-masing ligan biologis. Namun demikian, ini berbeda dari keadaan larutan pada mamalia, tidak seperti keadaan larutan, di mana infeksi mikroba menyebabkan kaskade protease, prekursor ligan yang tidak aktif terdegradasi menjadi protein, berubah menjadi tipe aktif, dan tipe yang diaktifkan berinteraksi dengan TLR. Pertanyaan menarik di masa depan adalah apakah TLR6 sendiri atau TLR2 dan TLR6 akan secara langsung mengikat MALP-2.
Selama persiapan naskah ini, Ozinsky dan rekannya membuktikan koordinasi TLR2 dan TLR6 dalam persepsi bakteri positif gram (28, 29). Mereka menunjukkan bahwa ekspresi berlebihan dari TLR2 atau TLR6 negatif yang dominan dalam sel RAW-TT10 akan sepenuhnya menekan produksi TNF-α dalam PGN dan staphylococci hot-yellow (28). Tetapi hasilnya tidak konsisten dengan hasil kami. Dalam kasus kami, TLR6 -/ -Cells merespons secara signifikan terhadap PGN. Selain itu, kami sebelumnya telah mengindikasikan bahwa bahkan TLR2-/-makrofag menghasilkan tingkat signifikan TNF-α dan IL-6 sebagai respons terhadap streptokokus bakteri kuning panas (30). Perbedaan ini mungkin disebabkan oleh perbedaan antara sistem.
Saya ingin menebak bahwa ligan TLR2 lainnya seperti PGN dan BLP lainnya dapat diakui secara selektif oleh heterodimer yang dibentuk dari TLR2 dan TLR lainnya. Makan ligan yang diakui oleh masin g-masing TLR dapat berkontribusi pada pengembangan perawatan baru berdasarkan pengakuan host patogen.
Gambar 1.
Penghancuran target kursi gen TLR6. (A) Kursi gen TLR6 tikus dan vektor penargetan. Kotak yang diisi menunjukkan exon kode. Enzim Terbatas: B, Bam HI; (B) Genomome DNA Southern Blotting. DNA genom tikus diekstraksi dari ekor tikus, dicerna dengan eco ri, dan membuat hybriddize dengan probe tanda radioaktif A. Jenis liar 2. 5kB dan gen oposisi yang ditargetkan 3. 2kB ditunjukkan dengan panah. (C) Analisis blot utara dari makrofag peritoneum asam thioglycolic yang diinduksi. Semua RNA diekstraksi, berenang secara elektrik, dipindahkan ke membran nilon, dan ditiupkan tinggi dengan probe cDNA TLR6 dan TLR2. Membran yang sama diulang kembali dengan gapdh cDNA. (D) Reaksi TLR6 -/ -Macrophages untuk LPS dan PGN. Tikus liar dan TLR6-/-makrofag peritoneum asam thioglycolic yang diturunkan dari tikus (5 × 10 4) distimulasi 24 jam dengan S. minnesota RE595 LPS atau S. aureus PGN, dan konsentrasi TNF-α dalam kultur dibersihkan. Diukur dengan ELISA. Hasilnya ditunjukkan oleh nilai rat a-rata triplet ± SEM.
Gambar 2.
Reaktivitas makrofag terhadap BLP. (A) BLP sintetis, MALP-2 dan PAM3CSK4(B-G) Produksi sitokin untuk MALP-2 atau PAM CSK.3CSK4Tlr6 -/ -tlr2 -/ -makrofag. Makrofag peritoneum (5 × 10 4) adalah MALP-2 (B-D) atau PAM dengan konsentrasi instruksi3CSK4(Konsentrasi TNF-α (B dan E), NO (C dan F), dan IL-12 (D dan G) dalam pengawasan kultur diukur. Distimulasi oleh 15 μg/mL B. Burgdorferi lipopeptida (Ospal dan OSPCL) atau T. pallidum lipopeptide (17L dan 47L) untuk mengukur TLR2 dan TLR6 dalam pengakuan Mycoplasma.
Gambar 3.
Aktivasi kaskade transmisi sinyal melalui TLR6 -/ -dan TLR2 -/ -. A dan B) EMSA menggunakan probe spesifik NF-κB. Makrofag peritoneum distimulasi oleh 0, 3 ng/ml MALP-2 (A) atau 1 ng/mL PAM.3CSK4Itu diberikan untuk periode ketika (b) dipesan. Ekstrak nuklir disiapkan dan aktivitas pengikatan DNA NF-κB diukur dengan EMSA. Panah menunjukkan kompleks NF-κB yang diinduksi. (C dan D) JNK uji kinase in vitro. Makrofag peritoneum 0, 3 ng/ml malp-2 (c) atau 1 ng/ml PAM3CSK4Distimulasi dengan (D). Larutan sel disiapkan dan kebal dengan antibodi ant i-JNK1. Aktivitas JNK kinase diukur dengan uji in vitro kinase menggunakan GST-C-Jun sebagai substrat. Otomatis, oksidasi diri. WB, Western blotting. (E) Kejadian bersama TLR2 dan TLR6 telah menyebabkan aktivasi gen reporter NF-κB. Struktur reporter luciferase kontrol NF-κB ditransformasikan dalam transformasi sementara dengan vektor ekspresi TLR yang ditunjukkan oleh reporter luciferase kontrol NF-κB. 36 jam setelah transfeksi, kami melakukan uji luciferase ganda.
Gambar 4.
Pengenalan MALP-2 membutuhkan TLR2 dan TLR6. (A) Produksi IL-6 dari MEF mutan yang merespons lipopeptida. Tipe liar, tlr6-/-tlr2-/-dan tlr2-/-tlr6-/-mef (3×14) berasal dari tikus, 10 ng/ml malp-2 atau 100 ng/ml Pam3CSK4Produksi IL-6 diukur oleh ELISA. (B) Konstruktif digunakan untuk infeksi retrovirus. (C dan D) TLR2 -/ -(C) atau TLR6 -/ -(D) MEF terinfeksi dengan retrovirus yang mengkode struktur ekspresi yang ditunjukkan. Sel (3 × 10 4) adalah 10 ng/ml MALP-2 atau 100 ng/ml PAM3CSK4Kami telah dikultur selama 18 jam dan mengukur konsentrasi IL-6 dalam supernatan kultur. (E dan F) TLR2-/-TLR6-/-MEF ke SBLP dari TLR6-/-MEF yang terinfeksi dengan retrovirus (E) atau struktur chimera (F) dengan TLR2 dan/atau TLR6. Hasilnya ditunjukkan oleh nilai rat a-rata triplet ± SEM.
