- C – Kimia;
- c12 – biokimia; bir;
- c12n – mikroorganisme atau enzim; komposisinya; pertumbuhan, pelestarian atau pemeliharaan mikroorganisme;
- C12N9/00 – Enzim; komposisinya; proses pembuatan, aktivasi, penghambatan, pemisahan atau pemurnian enzim;
- C12N9/0004 – Oksidoreduktase (1.)
- C12N9/0008 – Oksidoreduktase (1.
Definitions
- Invensi ini menyediakan enzim-enzim FDH yang baru, khususnya enzim-enzim FDH yang spesifik terhadap NADPH atau spesifik terhadap NADH.
- Invensi ini juga menyediakan penggunaan enzim baru ini dalam sistem katalitik untuk regenerasi NADPH atau NADH in situ.
- Invensi ini juga berhubungan dengan struktur kristal enzim baru dan penggunaan struktur ini.
- FDH format dehidrogenase
- koenzim redoks NADH
- Regenerasi NAD yang dimediasi FDH) telah memungkinkan penggunaan oksidoreduktase yang bergantung + secara efisien.
- Contoh industri terkenal dari regenerasi NAD+ menjadi NADH yang dimediasi FDH adalah produksi tert-L-leusin dan asam amino non-proteinogenik lainnya, yang mungkin berguna dalam produksi obat-obatan.
- Invensi ini menyediakan polipeptida format dehidrogenase (FDH) terisolasi yang spesifik untuk NADPH.
- FDH format dehidrogenase
- Spesifik NADPH dan spesifik NADP+ digunakan secara bergantian di sini untuk merujuk pada enzim FDH yang mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH.
- NAD + H-spesifik dan NAD + -Spesifikitas mengacu pada enzim FDH yang kompatibel dalam buku ini dan mengkatalisasi konversi dari NAD + ke NADH.
- Polipeptida FDH didefinisikan sebagai NADP H-spesifik jika kemampuan untuk meregenerasi NADPH dari NADP +lebih besar dari kemampuan untuk meregenerasi NAD +dari NAD +.
- Polipeptida FDH mungkin dapat memainkan NADPH dan NADH, tetapi agar spesifik untuk satu, kemampuan untuk meregenerasi seseorang harus ditingkatkan.
- NADP +-Spesifik Polipeptida FDH sesuai dengan penemuan ini lebih suka FDH spesifik NAD +yang diketahui 106 kali atau lebih NADP +.
- Protein FDH khusus untuk NADPH adalah NAD +NADP +/(KCAT/KM), yang lebih dari 20 kali, lebih disukai lebih dari 25 kali, lebih disukai. .
- Penemuan ini dilengkapi dengan polipeptida FDH yang terisolasi, dan loop pengenalan ribosa adenin terdiri dari asam amino besar pertama dan asam amino kedua, dan amino pertama dan asam amino kedua adalah asam amino kedua. Ruang sehingga dapat dikombinasikan dengan gugus fosfat.
- Asam limrat adalah bagian dari NADP.
- Polipeptida mengenali NADP +dan dapat mengkatalisasi konversi ke NADPH.
- Polipeptida juga dapat membuat konversi katalitik dari NAD +ke NADH.
- Polipeptida lebih suka NADP +daripada NAD +.
- Asam amino besar pertama adalah asam amino dengan volume fandelwaarus sekitar 110an.
- Asam amino besar pertama dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin.
- Asam amino besar juga dapat dipilih dengan arginin, histidin, lisin dan triptofan.
- Asam amino kedua dapat membentuk ikatan asam fosfat atau hidrogen atau io n-bonded, atau keduanya.
- Asam amino kedua memiliki muatan positif.
- Asam amino kedua dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari arginin, lidin, asam glutamat, glutamin dan asam aspartat.
- Asam amino pertama adalah glutamin atau tirosin.
- Asam amino kedua adalah arginin atau lidin.
- Asam amino pertama adalah glutamin, dan asam amino kedua adalah arginin.
- Asam amino pertama dan asam amino kedua tidak lebih dari 20 asam amino dalam urutan asam amino primer dari polipeptida FDH.
- Asam amino pertama dan asam amino kedua tidak lebih dari 10 asam amino dalam urutan asam amino primer dari polipeptida FDH.
- Asam amino pertama dan asam amino kedua mungkin berdekatan dengan urutan asam amino primer dari fdh polipeptida.
- Asam amino pertama dan asam amino kedua tidak lebih dari 10 holipeptida dalam polipeptida FDH terlipat.
- Asam amino pertama dan asam amino kedua adalah sekitar 9, 8, 7, 6, 5, 3, 3, atau 2 Angtrome lebih dari 2 Angtrom; Lebih dari 4 sudut dari sekitar 4 hop di peptida.
- Ini berbeda dengan enzim FDH spesifik NAD +yang diketahui, di mana struktur loop pengenalan ribosa adenin menghambat pengakuan NADP +.
- Loop pengenalan ribosa adenin lebih disukai kurang dari 20 asam amino, lebih disukai 15 asam amino, lebih disukai 10 asam amino.
- Loop pengenalan ribosa adenin dari enzim FDH baru terdiri dari SEQ ID yang disukai No: 1 atau 2 asam amino 222 hingga 228, lebih disukai asam amino 222 dan 227.
- Seni seni akan dapat dengan mudah mengidentifikasi loop pengenalan ribosa adenin dari enzim FDH lainnya berdasarkan pada homolog urutan asam amino primer dan / / atau struktur tiga dimensi.
- Penemuan ini adalah polipeptida yang terisolasi yang mengandung loop pengenalan ribosa adenin, dan urutan asam amino dari loop pengenalan ribosa adenin adalah sequing id: 1 atau seq no: 2 loop pengenalan ribosa adenin. dengan identitas array.
- Loop pengenalan ribosa adenin polipeptida adalah ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Loop pengenalan ribosa adenin dan setidaknya sekitar 60 %, 70 %, 80 %, 95 %, 95 %, 98 %atau lebih.
- Polipeptida ini memiliki loop pengenalan ribosa adenin yang sama dengan ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Loop Pengenalan Ribose Adenin.
- Loop pengenalan ribosa adenin lebih disukai seq ID NO: 1 atau 2 asam amino 222 hingga 228, dan lebih disukai loop pengenalan ribosa adenin terdiri dari SEQ ID NO: 1 atau 2 asam amino 222 hingga 227.
- Polipeptida adalah enzim FDH.
- Persen identitas array didefinisikan sebagai rasio asam amino dalam urutan, yang sama dengan asam amino yang disediakan dalam pengaturan setelah array diatur, celah diperkenalkan sesuai kebutuhan, urutan dimaksimalkan. Penyelarasan untuk menentukan persentase identitas array dapat dicapai dalam banyak hal yang diketahui oleh seni, misalnya, bagaimana menggunakan BLAST (Pusat Nasional untuk Informasi Bioteknologi Alat Pencarian Alignment Lokal). Fluktuasi persentase yang identik dapat, misalnya, dalam substitusi asam amino, penyisipan, atau penghapusan. Substitusi asam amino pada dasarnya konservatif karena asam amino yang diganti memiliki sifat struktural dan / atau kimia yang sama, misalnya, penggantian leusin dengan isoleusin.
- Penemuan ini memberikan polipeptida terisolasi yang terdiri dari urutan asam amino dari urutan asam amino yang memiliki ID sequing NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 dan setidaknya 50 % atau lebih.
- Polipeptida ini memiliki ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Urutan dan setidaknya sekitar 60 %, 70 %, 80 %, 95 %, 98 %atau urutan lebih tinggi.
- Polipeptida memiliki ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Urutan dan setidaknya 80 % dari urutan.
- Polipeptida memiliki urutan asam amino yang sama dengan SEQ ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2.
- Polipeptida adalah enzim FDH.
- Polipeptida sesuai dengan penemuan ini mengandung asam amino besar dalam posisi yang sesuai dengan asam amino 223 dari SEQ ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2.
- Asam amino besar adalah asam amino yang memiliki volume atau lebih sekitar 110an⁇ 3 atau lebih.
- Asam amino besar dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin.
- Asam amino besar juga dapat dipilih dengan arginin, histidin, lisin dan triptofan.
- Polipeptida sesuai dengan penemuan ini mengandung asam amino yang dapat membentuk telepon dan / atau ikatan ionik pada posisi yang sesuai dengan asam amino 224 dari SEQ ID no: 1 atau 2: 2.
- Asam amino memiliki muatan positif.
- Asam amino kedua dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari arginin, lidin, asam glutamat, glutamin dan asam aspartat.
- SEQ ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Asam amino yang mendukung asam amino 223 atau 224 dapat dengan mudah ditentukan oleh polipeptida FDH lainnya dengan mengatur array;
- Polipeptida menurut penemuan ini memiliki salah satu urutan SEQ ID NO: 3 hingga 19 dan setidaknya 50 %.
- Polipeptide adalah satu atau lebih ID SEQ no: 3 hingga 19.
- Polipeptida mungkin merupakan polipeptida yang ada secara alami.
- Polipeptida mungkin merupakan modifikasi polipeptida alami.
- Protein FDH mungkin adalah enzim FDH yang ada di alam alami Burkholderia sp.
- Protein FDH dapat dikodekan oleh gen yang berasal dari Burkholderia cenocepacia PC184.
- Protein ini disebut bcenfdh1 atau bsp184fdh (seq id no: 2) dan dikodekan oleh gen bcenfdh1.
- Protein FDH dapat dikodekan oleh gen yang diturunkan dari Burkholderia SP 383.
- Protein ini disebut bspfdh2 atau bsp383fdh (seq id no: 1) dan dikodekan oleh gen bspfdh2.
- Penemuan ini menyediakan polinukleotida yang mengkodekan polipeptida dari penemuan ini.
- Polinukleotida ini dapat dimasukkan dalam vektor rekombinan, di mana polinukleotida dapat dihubungkan ke promotor.
- Penemuan ini juga dapat menyediakan sel yang mengandung polinukleotida atau vektor ekspresi sesuai dengan penemuan ini.
- Penemuan ini memberikan mutan NAD +-Polipeptida FDH spesifik, di mana asam amino dari loop pengenalan ribosa adenin yang sesuai dengan SEQ ID NO: 1 atau 2 asam amino 223 adalah asam amino besar, dan polipeptida adalah polipeptida .
- Asam amino besar adalah asam amino yang memiliki volume atau lebih sekitar 110an⁇ 3 atau lebih.
- Asam amino besar dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin.
- Asam amino besar juga dapat dipilih dengan arginin, histidin, lisin dan triptofan.
- Polipeptida tipe mutan adalah polipeptida FDH yang dikenal.
- SEQ ID NO: 1 atau seq id nalicated amino acids yang mendukung asam amino 224 dalam 224 dapat membentuk asam amino dalam mutan polipeptida FDH spesifik dengan ikatan H dan / ionik dengan asam fosfat.
- Asam amino memiliki muatan positif.
- Asam amino dapat dipilih dari gugus yang terdiri dari arginin, lidin, asam glutamat, glutamin dan asam asparagat.
- Asam amino dalam posisi yang sesuai dengan ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 adalah glutamin, dan asam amino dalam posisi yang sesuai dengan tempat k e-224 SEQ ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 adalah arginine.
- NAD + spesifik mutan polipeptida FDH mengenali NAD + dan NADP +.
- Mutannya spesifik untuk NADP+.
- Mutan mengenali NADP+ lebih baik daripada polipeptida FDH spesifik NAD+ yang tidak dimodifikasi.
- Invensi ini menyediakan varian polipeptida FDH spesifik NAD+. dimana loop pengenalan adenin ribosa dimutasi setidaknya satu posisi untuk mengubah struktur polipeptida tiga dimensi dari loop pengenalan adenin ribosa sehingga dapat mengenali gugus fosfat.
- Varian polipeptida FDH spesifik NAD+ mampu membentuk ikatan H dan/atau ikatan ionik dengan gugus fosfat.
- Lingkaran pengenalan adenin ribosa terdiri dari asam amino besar pertama dan asam amino kedua yang dapat membentuk ikatan H dan/atau ikatan ionik dengan gugus fosfat.
- Setidaknya satu atau asam amino pertama atau kedua tidak terdapat dalam polipeptida FDH spesifik NAD+ yang tidak dimutasi.
- Asam amino besar pertama adalah asam amino dengan volume fandelwaarus sekitar 110an.
- Asam amino besar pertama dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin.
- Asam amino besar juga dapat dipilih dengan arginin, histidin, lisin dan triptofan.
- Asam amino kedua dapat membentuk ikatan asam fosfat atau hidrogen atau io n-bonded, atau keduanya.
- Asam amino kedua memiliki muatan positif.
- Asam amino kedua dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari arginin, lidin, asam glutamat, glutamin dan asam aspartat.
- Polipeptida mutan memiliki kemampuan yang lebih baik untuk mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH dibandingkan dengan enzim yang tidak dimutasi.
- Kemampuan untuk mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH ditingkatkan setidaknya 10 kali lipat, lebih disukai setidaknya 100 kali lipat, lebih disukai setidaknya 1000 kali lipat dibandingkan dengan polipeptida yang tidak dimutasi.
- Polipeptida mutan spesifik untuk NADP+.
- Invensi ini menyediakan metode untuk pembuatan polipeptida FDH yang mengenali NADP+:
- Polipeptida ini memiliki Seq ID No: 3 hingga 19.
- Polipeptida e) paling sedikit 10 kali lebih efisien, sebaiknya paling sedikit 100 kali lebih efisien, dan lebih disukai paling sedikit 1000 kali lebih efisien dalam mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH dibandingkan polipeptida (a).
- Polipeptida e) spesifik terhadap NADP+.
- Invensi ini menyediakan metode untuk pembuatan polipeptida FDH yang mengenali NADP+:
- Polipeptida e) mampu mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH.
- Polipeptida (E) memiliki setidaknya 10 kali kemampuan untuk mengenali NADP +daripada polipeptida induk, lebih disukai 100 kali, lebih disukai setidaknya 1000 kali lebih baik.
- Polipeptida E) dapat mengenali NAD + dan NADP +, dan melakukan katalis untuk mengubah masin g-masing menjadi NADH dan NADPH.
- Polipeptida e) spesifik terhadap NADP+.
- Setidaknya satu asam amino yang diperkenalkan adalah asam amino besar.
- Asam amino besar adalah asam amino sekitar 110an⁇ 3 atau lebih dari fandelwalus.
- Asam amino besar dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin.
- Asam amino besar juga dapat dipilih dengan arginin, histidin, lisin dan triptofan.
- Asam amino besar ini mengubah struktur tiga dimensi dari loop pengenalan ribosa adenin dari enzim FDH induk, enzim mengenali NADP +, dan dapat mengkatalisasi konversi ke NADPH.
- Penemuan ini menyediakan polipeptida yang diproduksi oleh salah satu penemuan.
- Polipeptida yang diproduksi dapat mengkatalisasi konversi dari NADP + ke NADPH.
- Enzim Dhidrogenase NADPH baru (FDH) dari penemuan ini tidak hanya menunjukkan aktivitas dydrogenase yang kuat, tetapi juga memberikan prioritas untuk NADP + daripada NAD +.
- FDH enzim hidrogen sogaisida
- Dari struktur kristal FDH baru ini, infrastruktur struktural enzim enzi m-hidrogen ditentukan untuk pertama kalinya.
- Protein FDH spesifik NADP +baru mirip dengan enzim FDH NAD +spesifik yang diketahui, dan sebagian besar interaksinya sama dengan yang diamati dalam FDH spesifik NAD +, tetapi adenin-ribosa ada perbedaan penting dan penting dalam loop pengakuan.
- NADP +-Penemuan spesifik FDH memungkinkan pemutaran NADPH di in situ. Oleh karena itu, sintesis kimia “hijau” yang efisien menggunakan enzim yang bergantung pada NADPH dimungkinkan untuk pertama kalinya, yang mencakup asam amino yang tidak alami, alkohol kiral dan sintesis poliol, tetapi tidak terbatas.
- Protein FDH baru yang dikodekan oleh saham Burkholderia, SEQ ID NO: 1 dan 2, semua menunjukkan aktivitas FDH yang kuat, masin g-masing fermentasi kuat NADP +, (KCAT/KM) NADP +/(KCAT/KM). BCENFDH1, 39 di BSPFDH2, sekitar 105 kali preferensi NADP +kimia.
- BCENFDH1 BSP184FDH
- BSPFDH2 BSP383FDH
- GLN223 adalah elemen pengenalan penting untuk asam fosfat NADP +, dan BSPFDH2 dan BCENFDH1 khusus untuk fosfoli NADP +.
- BCENFDH1 dan BSPFDH2 adalah contoh FDH liar yang secara alami lebih suka NADP +daripada NAD +.
- Terlepas dari kenyataan bahwa lebih dari 200 upaya untuk mengubah rasa sorakan FDH khusus NADH dalam 30 tahun terakhir telah dilaporkan, hanya ada beberapa perbaikan, yang juga merupakan keberhasilan yang terbatas. Penemuan ini jelas (lihat Tabel 4).
- Enzim Adenin-FDH dengan glutamin pada loop pengenalan ribosa dapat dioperasikan / dimodifikasi sehingga menjadi NADP + spesifik. Ini dapat dicapai dengan memperkenalkan asam amino besar seperti glutamin dalam loop pengenalan adenin-ribosa, yang setara dengan tempat ke-223 di BCENFDH1 dan BSPFDH2.
- Asam amino besar seperti glutamin
- Protein spesifik NAD +yang diketahui memiliki asam asparagat dalam loop pengenalan adenin-ribosa dalam posisi yang sesuai dengan tempat ke-223 di BCENFDH1 dan BSPFDH2.
- Glutamin ini dapat diperkenalkan oleh rekayasa genetika;
- Residu asam asparagat dari NAD + spesifik enzim adenin pengenalan adenin FDH spesifik berada di tempat ke-223 BCENFDH1 dan BSPFDH2, dan berikatan dengan gugus hidroksil OH-3 dari ribosa adenin dari NAD +.
- Residu ini sangat diawetkan di banyak NAD +ketergantungan FDH dengan lipatan Rosman, dan memainkan beberapa peran penting dalam spesifisitas NAD +.
- NAD+ -Spesifik Rasio Spesifisitas FDH (KCAT/KM) NADP+/(KCAT/KM) NAD+ berada dalam kisaran 10 3-10 30.
- Spesifisitas NAD+FDH spesifik dapat diubah dengan mengubah asam asparagic dari loop pengenalan adenin-ribosa ke tempat ke-223 di BSPFDH2 dan BCENFDH1 menjadi glutamin.
- Penemuan ini menyediakan polipeptida FDH yang telah dioperasikan untuk mengubah pemilihan kimia antara NADP + dan NAD +.
- Polipeptida FDH lebih suka NAD +di alam, tetapi dapat dioperasikan untuk lebih suka NADP +.
- FDH Polypeptide adalah Adenin-Seq ID No.
- Suatu bentuk polipeptida FDH alami yang memiliki asam aspartat dalam loop pengenalan adenin-ribosa pada posisi yang sesuai dengan posisi 223 dari Seq ID No: 1 atau 2, dan oleh karena itu memiliki preferensi untuk polipeptida NAD + FDH.
- Bentuk alami dari protein FDH memiliki glutamin dalam loop pengenalan adenin-ribosa pada posisi yang sesuai dengan posisi 223 dari Seq ID No: 1 atau 2, sehingga lebih menyukai NADP +, tetapi memiliki aspartat pada posisi ini dan oleh karena itu dapat direkayasa untuk mengenali NAD+ dan sebaiknya spesifik untuk NAD+.
- Invensi ini menyediakan metode untuk merekayasa spesifisitas polipeptida FDH dengan mengendalikan asam amino yang dimasukkan ke dalam loop pengenalan adenin pada posisi yang sesuai dengan posisi 223 dari Seq ID No: 1 atau 2.
- Polipeptida FDH menurut penemuan ini dapat mempunyai spesifisitas kofaktor ganda; polipeptida tersebut dapat digunakan dalam sintesis berbagai produk tingkat industri.
- Invensi ini menyediakan penggunaan polipeptida menurut penemuan ini dalam konversi NADP+ menjadi NADPH atau konversi NAD+ menjadi NADH.
- Penemuan ini menyediakan penggunaan polipeptida menurut penemuan dalam proses oksidoreduktase.
- Invensi ini menyediakan suatu metode untuk konversi NADP+ menjadi NADPH atau konversi NAD+ menjadi NADH, yang terdiri dari langkah-langkah penyediaan polipeptida FDH menurut penemuan dan menambahkannya ke NADP+ atau NAD+.
- Penemuan ini menyediakan proses oksidoreduktase yang terdiri dari penyediaan polipeptida FDH sesuai dengan penemuan dan menambahkannya ke dalam campuran reaksi oksidoreduktase.
- Polipeptida FDH mengubah NADP+ dalam campuran reaksi menjadi NADPH dan/atau NAD+ dalam campuran reaksi menjadi NADH.
- Polipeptida penemuan ini dapat digunakan dalam sejumlah reaksi reduksi oksida yang memanfaatkan NADPH.
- Polipeptida menurut penemuan ini dapat digunakan dalam proses oksidoreduktase untuk meregenerasi NADH atau NADPH.
- Polipeptida digunakan untuk meregenerasi NADPH.
- Proses oksidoreduktase dapat mengakibatkan penyisipan oksigen C-H, penyisipan oksigen C-C, pengiriman hidrida atau aminasi reduktif.
- Proses oksidoreduktase mungkin termasuk reaksi monooksigenasi, oksidasi Bayer-Villiger, reduksi keton, atau sintesis asam D-amino.
- Proses oksidoreduktase secara regioselektif dan stereoselektif menyisipkan atom oksigen ke dalam ikatan C-H yang tidak aktif, misalnya propilbenzena, menghasilkan 1-fenil-1-propanol.
- Hal ini berhasil dicapai dengan menggabungkan kerja enzimatik dari BspFDH2, atau FDH spesifik NADP+ lainnya sesuai dengan penemuan ini, dengan kerja enzim sitokrom-P450-monooksigenase BM-3. Semua P450 bergantung pada NADPH.
- NADP + yang terbentuk diubah kembali menjadi NADPH melalui aksi FDH dengan asam format.
- Oleh karena itu, transformasi atom secara keseluruhan merupakan penguraian O2, dengan ion hidrida disuplai dari asam format dan menggunakan NADP+ sebagai “pesawat ulang-alik hidrida”.
- Proses oksidoreduktase menyediakan sintesis biokatalitik Bayer-Villiger dari lakton murni secara optik dengan memasukkan atom oksigen ke dalam ikatan C-C pada bahan awal yang sesuai.
- Ini dapat mencakup oksidasi biokatalitik Bayer-Villiger (BV) untuk mengubah sikloheksanon menjadi kaprolakton.
- Biokatalis tipe BV Bayer-Villiger
- Hal ini dapat dicapai dengan menggabungkan kerja enzimatik dari BspFDH2, atau FDH spesifik NADP+ lainnya menurut penemuan ini, dengan kerja enzimatik dari sikloheksanon monooksigenase (CHMO).
- Proses oksidoreduktase melibatkan penambahan D-Dapat melibatkan sintesis stereoselektif asam amino.
- Ester ini merupakan zat antara farmasi kiral penting yang digunakan dalam sintesis enantioselektif, misalnya, slagenin B dan C, penghambat reduktase HMG-CoA.
- Hal ini dapat dicapai dengan menggabungkan kerja enzimatik dari BspFDH2, atau FDH spesifik NADP + lainnya sesuai dengan penemuan ini, dengan kerja enzimatik dari β-ketoreduktase (⁇ KR) KRED101.
- Reaksi reduksi kimia, regioselektif, dan diastereoselektif yang dimediasi KR dari keton, asam keto, dan ketoester menjadi alkohol kiral memungkinkan sintesis obat-obatan utama mulai dari antidepresan hingga agonis adrenergik.
- Proses oksidoreduktase mungkin melibatkan sintesis yang dimediasi ketoreduktase, seperti sintesis asam amino yang tidak alami (varian dari sintesis tert-leusin Degussa).
- Asam amino 2-oxylglycin 2-oxyacic, konversi amino reduksi tiga dimensi, adalah BSPFDH2 atau efek enzim NADP +spesifik lainnya, dan efek enzim dari dehidrogenase asam amino (DAADH).
- Asam D-amino telah digunakan sebagai komponen utama dari banyak senyawa biologis, seperti antibiotik, perawatan infertil, antikoagulan, dan insektisida. Anpicillin (termasuk D-phenylglycin) saat ini diproduksi pada skala 5. 000 ton atau lebih setahun.
- Penemuan ini menyediakan metode untuk membangun mutan enzim FDH induk, di mana induk FDH bukan BSP383FDH, tetapi variabel ini memiliki aktivitas FDH dan setidaknya satu karakteristik yang berbeda dari FDH induk.
- Metode ini juga mencakup proses pengujian varian FDH yang dibangun di III) untuk mengkonfirmasi bahwa karakteristik yang dipilih sedang berubah.
- Karakteristik yang diubah adalah spesifisitas enzim: stabilitas enzim di bawah kondisi yang berbeda seperti pH, suhu atau lingkungan kimia;
- FDH induk dapat dimodifikasi dengan loop pengenalan ribosa adenin. Modifikasi ini memiliki efek mengubah spesifikasi koeksistensi FDH induk.
- Loop pengenalan ribosa adenin lebih disukai terdiri dari asam amino yang kompatibel dengan asam amino BSP383FDH 222 dan 227.
- Dengan modifikasi III), FDH induk mirip dengan BSP383FDH di situs modifikasi.
- Modifikasi ini dapat dicapai dengan kehilangan, mengganti, atau memasukkan satu atau lebih asam amino dalam polipeptida FDH induk.
- Penemuan ini memberikan penggunaan koordinat tiga dimensi BSP383FDH untuk menentukan modifikasi enzim FDH induk untuk mengubah satu atau lebih karakteristik induk FDH.
- Penemuan ini juga menyediakan protein yang dimodifikasi yang dibuat sebagai hasil dari penggunaan koordinat tiga dimensi BSP383FDH.
- FDH induk mungkin BSP383FDH atau enzim FDH lainnya.
- Karakteristik yang diubah adalah untuk mengubah spesifisitas enzim, meningkatkan stabilitas termal enzim, untuk meningkatkan stabilitas enzim di lingkungan tertentu, misalnya, pH spesifik atau pelarut berbasis air atau no n-air tertentu. Dari kelompok yang meningkatkan kristalinasi, meningkatkan karakteristik dinamis enzim, dan, misalnya, untuk meningkatkan level dan / atau kecepatan ekspresi protein di Escherichia coli.
- Spesifisitas enzim dapat mengubah spesifisitas kompromi, seperti, misalnya, dari NAD +ke NADP +, atau dari NADP +ke NAD +.
- Kekhususan enzim dapat diubah menjadi substrat yang berbeda.
- Metode penemuan ini juga dapat digunakan untuk menentukan cara membuat protein fusi yang mengandung enzim FDH induk.
- Gbr. 5 (a) adalah kromatografi.
- Gbr.
- Gambar 5 (c) adalah spektrum yang volume deconcon maksimal;
- Gbr. 6 (a) adalah kromatografi.
- Gbr. 6 (b) adalah status mult i-biaya “mentah”.
- Gambar 6 (c) adalah spektrum voluminous maxent decon;
- Gbr.
- Gbr.
- Gbr.
- Gambar 14 adalah PLYSS PLYSS BL21 (DE3), termasuk vektor konstruksi PET23B-BSP383FDH, analisis SDS-PAGE dari protein BSP383FDH, dan PET23B-BSP383FDH plasmid BSP383FDH.
- Gambar 16 menunjukkan oksidasi 1-profrom oksidasi 1-profroma oleh P450 BM3 liar dan mutan dalam reaksi regeneratif NADPH: pengikatan Citochrome P450 BM3/BSPFDH2.
- Gbr.
- Gbr. Lebih khusus
- Burkholderia sp.
- SWED MONAS GENUS 101 Pseudomonas sp.
- Candida Methylica (CMETFDH, EMBL X81129) -Angka: 6:
- Hansenura Polimorfa (Hanfdh, EMBL P33677) -seqid: 7:
- Moraxella sp. C-1 moraxella pedas (morfdh, embl y13245) -seqid: 8 :::::::
- Neurospora crassa neuros pola classa (neufdh, EMBL L13964) -seqid: 9:
- PARACOCCUS SP.
- Gbr. 19 dan 20 menunjukkan efek suhu pada stabilitas enzim BSP184FDH dan BSP383FDH.
- BSP184FDH (2, 1 mg/mL) dan BSP383FDH (1, 5 mg/ml) diinkubasi selama 20 menit pada suhu yang berbeda selama buffer Tris-HCl 20mm Ph7. 2, dan kemudian disimpan pada 0 ° C sampai saat itu digunakan. Sisa kegiatan ini adalah uji dalam kondisi uji standar, diwakili oleh persentase aktivitas.
- BSP184FDH (2, 1 mg/ml) dan BSP383FDH (1, 5 mg/ml) diinkubasi pada 60 ° C dan 70 ° C pada 60 ° C dan 70 ° C selama buffer Tris-HCl 20mm Ph7. 2, dan disimpan pada 0 ° C. Aktivitas yang tersisa diuji dalam kondisi uji standar dan diwakili oleh persentase aktif.
- Gbr.
- Sumbu x menunjukkan angka sumur, dan sumbu Y menunjukkan tingkat aktif.
- Aktivitas NAD + ditunjukkan oleh bilah warna yang cerah, dan aktivitas NADP + ditunjukkan pada bilah yang lebih gelap.
- Well 1A-1H (bagian yang terlampir dalam bingkai) kompatibel dengan aktivitas liar (WT), dan sumur 9-103 kompatibel dengan koloni acak yang diuji.
- BSP184FDH dan BCENFDH1 merujuk pada enzim FDH yang sama, dan digunakan secara kompetatif dalam buku ini.
- BSP383FDH dan BSPFDH2 merujuk pada enzim FDH yang sama, dan digunakan dalam kompatibel dalam buku ini.
- Dehidrogenase adalah katalitik oksidasi asam ionat ionat menjadi CO dan hidrogen. NAD H-Dehidrogenase spesifik memiliki urutan asam amino tinggi (40 % atau lebih), dan berbagi struktur tiga dimensi yang serupa (Lamzin, V. S. et al., Jurnal Biorogy Molecular 236, 759-785 (1994)), situs katalyst dari Gerakan hidrida jelas sama.
- Gbr.
- Gbr.
- Gbr.
- Bcenfdh1 seq id no: 2
- BSPFDH2 SEQ ID NO: 1
- Protein BCENFDH1 dan BSPFDH2 berasal dari Burkholderia sp.
- Gen BCENFDH1 dan BSPFDH2 diamplifikasi dari DNA genomik dan diekspresikan pada sistem ekspresi Caucina coli standar (lihat metode berikut) pada tingkat sekitar 20 mg/L.
- Produk gen ini dikarakterisasi termasuk pengurutan dan spektrometri massa protein (ESI+: BcenFDH1 42462 Da dihitung, 42462 Da ditemukan; BspFDH2 42466 Da dihitung, 42469 Da ditemukan), dan identitas strukturalnya dikonfirmasi.
- Urutan protein ditunjukkan pada Gambar 18.
- FDH dari Candida methylica 1, 7 ⁇ 10 4 kali lebih efektif pada NAD + dibandingkan NADP + dalam oksidasi asam format (Tabel 1 dan 2 menunjukkan bahwa Candida methylica (CmFDH) FDH, BspFDH2, , asli, menunjukkan selektivitas koenzim BcenFDH1, SceFDH dan PseFDH , bersama dengan rekan FDH mutan mereka dengan spesifisitas FDH yang berubah).
- Tabel 1 dan 2 menunjukkan preferensi koenzim dari Candida methylica (CmFDH) FDH asli, BspFDH2, BcenFDH1, SceFDH, dan PseFDH, masing-masing, bersama dengan rekan FDH mutan mereka dengan spesifisitas FDH yang berubah.
- Data berasal dari Serov dkk (Jurnal Biokimia 367 (3), 841-847 (2002)) dan Andreadeli dkk (FEBS J. 275, 3859-3869 (2008)).
- ADH alkohol dehidrogenase
- KIADH III ADH III dari Kluyveromyces laktis
- DroADH ADH turunan Drosophila
- SceADH ADH dari Saccharomyces cerevisiae
- AlaDH alanin dehidrogenase
- SheAlaDH AlaDH dari Shewanella sp.
- Penyelarasan urutan asam amino FDH pada Gambar 18 menunjukkan bahwa aspartat yang berikatan dengan gugus hidroksil dari gugus adenin ribosa NAD+ sangat terkonservasi dalam banyak dehidrogenase yang bergantung pada NADH, tetapi dehidrogenase yang bergantung pada NADPH baru yang dijelaskan di sini Hal ini menunjukkan bahwa itu tidak disimpan di FDH.
- BspFDH2 ditentukan dalam bentuk aslinya, biner (NADP +), dan terner (NADP + /formate/azide) menggunakan kristalografi sinar-X pada resolusi 1, 5‾2, 5⁇.
- Topologi BspFDH2 serupa dengan yang sebelumnya diamati untuk FDH spesifik NAD + (Lamzin, V. S. et al., Journal of Molecular Biology 236, 759-785 (1994)).
- Gambar 3 menunjukkan dasar struktural pengenalan dan manipulasi koenzim di Burkholderia sp.
- Gambar 3(a) menunjukkan representasi kerapatan elektron dimer FDH dengan ligan NADP/format yang direpresentasikan sebagai bola dan tongkat.
- Cincin nikotinamida tidak teratur di kompleks biner, dan keteraturan (lihat Gambar 1 b) hanya diamati di kompleks terner. Kristal yang ditumbuhkan di bawah konsentrasi asam format tinggi (asam format 500 mM, 0, 5 mM azida) menunjukkan kepadatan ligan zat pereduksi yang berbeda, yang identitasnya secara resmi tidak diketahui pada resolusi ini. Atom pusatnya adalah 2, 7 dari C4 cincin nikotinamida.
- Gbr. 3 (b) menunjukkan BSP383FDH (menunjukkan bagian dari kepadatan elektronik dari bagian NADP +) dalam loop pengenalan adenin-ribosa, dan FDH yang bias yang menggunakan NAD + (SUP Monas 101; PDB Code 2nad) terungkap melalui tumpang tindih.
- Pengenalan ribosa dari NAD+FDH spesifik terutama disebabkan oleh asam asparagic (setara dengan tempat k e-223 dalam enzim BSP), yang menciptakan H-tidak ada pada kelompok hidroksil Ribosa O2 dan O3.
- Asam asparagicic dalam posisi setara dengan tempat k e-223 di enzim BSP
- Glutamin, residu asam amino yang lebih besar, ada pada posisi yang sesuai (GLN223), yang sebaliknya membawa persepsi bossida fosfat (lihat Gambar 3 (b)).
- Ali h-alih rantai samping glutamin, ali h-alih berinteraksi dengan ribosa, ia menyediakan jaringan pengikatan hidrogen “ultr a-sekunder” dari amida rantai utama ALA201 ke calubonil rantai samping GLN223, dan amida pada rantai samping ini adalah yang utama Rantai karbon dari His225.
- Dalam loop ini, Valle yang dimasukkan dalam loop ini mengubah lingkungan Arg224 di BSPFDH2 sehingga dapat berinteraksi dengan dua oksigen fosfor Bauss melalui NH2 dan nitrogen glygain yang diprotonisasi N.
- Fosfat yang tersisa juga menerima ikatan hidrogen dari rantai utama His225 amida.
- GLN223 adalah elemen pengenalan penting dari NADP+fosfat, dan Arg224 lebih dipesan dan berinteraksi dengan asam fosfat.
- Pengkhianatan ini terlibat dalam mutasi asam amino dari enzim FDH lainnya yang sesuai dengan asam amino 22 3-i n-place dalam BSPFDH2. Lebih khusus lagi, enzim mutan CMETFDH-D195Q diciptakan dengan mengubah residu asam amino dari permen nadh-dependent (WT) Candy (WT) (WT) Candidida FDH enzim CMETFDH-WT, residu asam amino tempat 195.
- Gbr.
- Pengenalan Asam Asparagik dibalikkan spesifisitas kronis sehingga KCAT/KM (NAD +)/KCAT/KM (NADP +) menjadi & GT;
- Kontrol koenzim NADH vs NADPH (bertentangan dengan intuisi, residu GLN yang lebih besar, struktur geometris dari sorakan dan area aktif untuk mengakomodasi substituen fosfat NADPH O-3 yang lebih besar. karboksilat-muatan negatif dari rantai samping, O-3 ′ fosfat tidak lagi menjadi penolakan Coulon).
- Aktivitas BcenFDH1 dan BspFDH2 sedikit berubah pada kisaran pH 4, 5-9 (Gambar 13A dan 13B), dan enzim tetap sangat aktif pada pH serendah pH 4 dan setinggi 10, 5.
- BcenFDH1 dan BspFDH2 dapat digunakan secara efektif dalam kombinasi dengan sejumlah besar enzim yang menunjukkan aktivitas yang luas.
- BcenFDH1 dan BspFDH2 juga merupakan enzim yang sangat stabil (keduanya stabil selama beberapa minggu pada suhu kamar, dan aktivitasnya tidak hilang setelah inkubasi pada suhu 55°C selama 2 jam (walaupun keduanya mengalami denaturasi pada suhu 80°C). ), dapat digunakan untuk waktu yang lama.
- Gambar 19 dan 20 menunjukkan termostabilitas BcenFDH1 dan BspFDH2.
- BcenFDH1 dan BspFDH2 juga dapat disiapkan dengan cara yang sangat hemat biaya.
- Asam amino di Gln223 atau posisi yang sesuai dengan Gln223 di BspFDH2 memainkan peran penting dalam spesifisitas NADP + /NAD +.
- Sistem sitokrom P450 adalah superfamili monooksigenase yang ada di mana-mana pada tumbuhan, hewan, dan prokariota.
- Genom manusia mengkodekan lebih dari 50 anggota famili ini, sedangkan genom tanaman Arabidopsis mengkodekan lebih dari 250 anggota.
- Sistem sitokrom P450 Pada mamalia, sistem sitokrom P450 terutama terdapat di retikulum endoplasma hati dan usus halus, dan berperan penting dalam detoksifikasi zat asing (senyawa xenobiotik) melalui metabolisme oksidatif.
- Enzim yang mengkatalisis reaksi ini disebut monooksigenase (atau oksigenase fungsi campuran).
- Produk terhidroksilasi yang dihasilkan memiliki beragam kegunaan potensial, termasuk sebagai bahan penyusun polimer, perantara dalam sintesis antibiotik, dan bahan parfum.
- Sitokrom tipe liar P450-BM3 (WT P450 BM3, 2, 4 mg/mL, 300⁇ L) ditambahkan dan dikocok pada suhu kamar. Reaksi dipantau dengan GC-MS (Rt ⁇ 3, 2 menit). Setelah 15 jam, campuran reaksi diekstraksi dengan DCM (3⁇1 mL), gabungan fase organik dikeringkan, pelarut dihilangkan, dan 1-fenilpropan-1-ol (2a di atas, konversi berdasarkan kromatogram GC > 99% ).
- Data GC-MS dikumpulkan menggunakan kolom Zebron (Fase ZB-5, 0, 25 mm ⁇ 15 m, ketebalan film 0, 25 ⁇ m; Phenomenex) pada sistem GCT (GC: Agilent G890 series, MS: Micromass) dalam mode pemindaian penuh. (m/z 50-300).
- Program GC berikut digunakan: 80°C (penahanan 2 menit), 80-280°C (10°C/menit), 280°C (penahanan 5 menit).
- Gambar 16 merupakan kromatogram gas kiral hasil oksidasi 1-propilbenzena menggunakan WT P450 BM3.
- Substrat CHMO adalah:
- Dengan menggabungkan efek enzim BSPFDH2 BSPFDH2 dengan efek enzim dari cyclohexanon monoxygenase (CHMO), pengikatan oksigen C-C, oksidasi pembeli-voligar (lihat Gambar 4) (lihat Gambar 4 B), dan cyclohexanon (lihat Gambar 4 (lihat gambar cyclohexanon cyclohexanon (cyclohexanon cyclohexanon (Cyclohexane (Cyclohexan. ). 3) dikonversi menjadi caprolacton (4) (tingkat konversi 99%atau lebih, selesai dalam 4 jam).
- Chmo Cyclohexanon monoxygenase
- B-V Baeyer-Viliger
- Reaksi dipantau dengan GC-MS (RT⁇ 3, 1 menit). Empat jam kemudian, campuran reaksi diekstraksi dengan DCM (3⁇ 1 mL), fase organik gabungan dikeringkan, pelarut dihilangkan, dan oxyepan-2-on (4 di atas, tingkat konversi 99%atau lebih berdasarkan berdasarkan kromatogram GC) yang saya dapatkan.
- Kettra Ductase adalah katalis biologis yang berharga yang memungkinkan penebusan/ oksidasi giasteroo, dan memungkinkan pemisahan dan sintesis alkohol kiral dari keton, asam ketoik, dan kettell.
- Enzim reduksi keto dapat disaring dengan keton target. Akibatnya, reaksi yang ditemukan dapat ditingkatkan dengan cepat untuk menghasilkan jumlah alkohol kiral.
- 4-chloro-3-oxobonnate diperkenalkan oleh tiga dimensi secara selektif, dan anorat optik D- (S) -4-chloro-3-ethyl ester diperoleh (6 di atas).
- D- (S) -4- Chloro-3-Hydroxibuttanate Ethyl ester adalah perantara farmasi kiral yang penting yang digunakan dalam sedagenin B, C, dan penghambat enzim reduksi HMG-COA.
- Ini dapat dicapai dengan efek enzim dari BSPFDH atau FDH NADP + -spesifik lainnya oleh efek enzim β-ketradactase (⁇ KR) Kred101.
- Reaksi reduksi kimia, regioselektif, dan diastereoselektif yang dimediasi KR dari keton, asam keto, dan ketoester menjadi alkohol kiral memungkinkan sintesis obat-obatan utama mulai dari antidepresan hingga agonis adrenergik.
- Proses lodactase oksid dapat disertai dengan ketreduktase, seperti sintesis asam amino non-alami (sejenis sintesis tert-leusin degussa).
- Asam d-hexyl glycine 2-oxyicic adalah konversi amino reduksi selektif tiga dimensi dari BSPFDH, atau efek enzim NADP +lainnya-efek enzim FDH spesifik dapat dicapai dengan aksi enzim Dehydrogenase (DAADH). dengan menggabungkan.
- Asam D-amino telah digunakan sebagai komponen utama dari banyak senyawa biologis, seperti antibiotik, perawatan infertil, antikoagulan, dan insektisida. Anpicillin (termasuk D-phenylglycin) saat ini diproduksi pada skala 5. 000 ton atau lebih setahun.
- Daadh D-Amino Acid Dehydrogenase
- Sistem enzim ini mengkatalisasi amino penebusan menjadi asam 2-ketoat menjadi asam 2-amino dengan adanya sumber amonia.
- Oleh karena itu, proses ini cenderung berguna untuk sintesis asam d-amino, tetapi nikotin amida yang kompisibel NADPH sangat diperlukan.
- Berikut ini merupakan sintesis asam amino D-amino menggunakan DAADH dan NADPH:
- Asam D-amino ada di alam, terutama dalam antibiotik peptida tertentu, dan dalam jenis mikroorganisme tertentu. Asam D-amino telah banyak digunakan sebagai perantara dalam obat dan sebagai komponen utama dari banyak senyawa biologis seperti antibiotik β-laktam, suplemen reproduksi, antikoagulan, dan insektisida. Anpicillin (termasuk D-phenylglycin) saat ini diproduksi pada skala 5. 000 ton atau lebih setahun.
- Daadh D-Amino Acid Dehydrogenase
- 2-oxooctane acid 0, 5 m, 500⁇ L, aq
- Buffer kalium fosfat 100 mm, pH 7, 6, 2 ml
- 4m, 1 ml natrium
- Husanosum albumin 100 mg/ml, 300 ❓ l
- NADP + 30 mm, 250 ❓ l
- Bspfdh2 17 mg/ml, 300⁇ l
- Gen target FDH diamplifikasi oleh PCR yang dimasukkan dengan situs terbatas NDEI dan XHOI. Setiap gen FDH berhenti kodon hilang untuk memungkinkan c-terminal ta g-nya. Gen yang diamplifikasi dikloning oleh vektor ekspresi.
- Primer maju dan primer terbalik untuk amplifikasi BCENFDH1 adalah sebagai berikut:
- Primer maju dan primer terbalik untuk amplifikasi BSP383-FDH BSPFDH2 (BSP383-FDH) adalah sebagai berikut.
- Kondisi PCR adalah 29 siklus, itu 50 detik pada 94 ° C, anil 50 ° C selama 1 menit, dan diperpanjang selama 5 menit pada 72 ° C.
- Campuran PCR termasuk pfuturbo DNA polimerase (stratagene) (2. 5U), 10⁇ buffer reaksi PFU (4⁇ L), DNTPS (10mm, 1⁇ L), DNA cetakan, primer maju dan primer terbalik (100pmol/⁇ L, L, , Masin g-masing 5⁇ l) termasuk dalam jumlah air hukum dalam jumlah 50⁇ l.
- Produk PCR diisolasi dan dicerna dengan NDEI dan Xho i-Restricted endn u-Lease.
- DNA yang dicerna dimurnikan, dikloning ke vektor PET23B NDEI dan XHOI, dan memperoleh konstruksi ekspresi akhir dari PET23B-BSP184FDH dan PET23B-BSP383FDH.
- Buka setiap transformator (20-200⁇ L) pada pelat LB-Agar dengan antibiotik yang sesuai (PET23B menggunakan 100⁇ g/ml amp), dan semalam dengan inkubator 37 ° C (10).
- Pet23b ditambahkan ke antibiotik yang sesuai (100⁇ g/ml amp) dan dikultur semalam (10-16 jam) dengan inkubator pada suhu 37 ° C.
- Metode lain digunakan untuk transformasi cepat. Metode ini hanya cocok untuk pemilihan ampisilin. Sederhananya, sel yang kompeten 50⁇, yang dicairkan di atas es, ditambahkan langsung ke setiap solusi reaksi ligasi. Setiap botol dicampur ringan dan diinkubasi di atas es selama 5 menit. Setelah itu, sebarkan setiap konverter traitical pada pelat LB-Agar (dihangatkan di muka) dengan antibiotik yang sesuai (100⁇ g/ml amp untuk PET23B), dan semalam dengan inkubator pada suhu 37 ° C (10-16 jam) dikultur.
- Campuran reaksi adalah sebagai berikut: plasmid 10 ❓ L dimurnikan dari 1 mL kultur semalam, buffer BAMHI 2 ❓L, BSA (konsentrasi akhir: 1. 5), Dh2 O 6. L, NDEI (2. 5U), dan XHOI (XHOI (2. 5 U)). 2. 5U) Akhiri nukurease 1 ❓ L. 5U) dan 1⁇ l xhoi (2. 5U) endn u-leause ditambahkan ke total kapasitas 20⁇ L. Campuran reaksi cukup dicampur, disentrifugasi dalam waktu singkat, dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 1 jam dan 45 menit.
- Escherichia coli BL21 (DE3) plys yang mengandung konstruk ekspresi dikultur pada 37 ° C dalam media LB yang mengandung 100⁇ g/ml anpicillin dan 34⁇ g/ml chlorohamphenicol. Alicoat dikumpulkan pada periode waktu tertentu. Ekspresi dievaluasi dengan membandingkan pola pita yang diperoleh dengan analisis SDS-PAGE dari semua ekstrak sel dengan kontras negatif (yaitu, Escherichiaosa BL21 (DE3) PET23B). Protein pelarutan dievaluasi dengan prosedur standar menggunakan analisis SDS-PAGE.
- Analisis SDS-PAGE adalah 49mm Tris, Glycine 384mm (W/W/W/(W/W/W/W/W/W/W/W/W/W/W/)) SDS, Ph8 Saya pergi dengan buffer berjalan termasuk . 5. ) Pewarnaan biru yang indah digunakan untuk mendeteksi polipeptida.
- Gbr. Lane adalah sebagai berikut: 1 lukisan yang tidak larut;
- 10ml 10 mL buffer bebas es A (20mm Tris-HCl, pH7. 8, 0, 5m NaCl, 0, 5m NaCl, 10 mL DNAese (Sigma-aldrichl) sekitar 3g pasta sel lembab sekitar 3g DNAese. Saya menangguhkan Imidazole 5mm).
- Ultrasound diperlakukan menggunakan Sonipreptm 150 Solo (Sanyo, Tokyo, Jepang) dengan probe berdiameter 3mm, dan se l-sel dihancurkan.
- Suspensi sel disimpan di atas es, dan perawatan ultrasonik dilakukan dengan 15 detik meledak dan interval 45 detik. Proses ini diulang enam kali.
- Ekstraksi sel yang diperoleh adalah 28. 000⁇ g, dan 4 ° C selama 30 menit.
- Ekstrak bebas sel dikeluarkan dengan hat i-hati dan disaring di unit filter 0, 45 mikron (Sartoriustm, Goettingen, Jerman).
- Solusi yang diekstraksi jelas setara dengan kolom HitRap nikel 1ml (BiosciencestM Amerika) dengan kecepatan aliran 1 mL/menit. Kromatografi kolom dilakukan pada suhu 4 ° C. Setelah itu, kolom dicuci di area lebar dengan buffer A (kapasitas 12 kolom) untuk menghilangkan zat bersatu. Selanjutnya, setelah pengangkatan sebagian besar protein yang terkontaminasi dengan membersihkan dengan 5mm imidazole dalam buffer A (kapasitas 10 kolom), tag FD H-nya yang dikombinasikan ulang oleh imidazol 300mm dalam buffer A dielusi.
- Setelah pengayaan, buffer diganti dengan menggunakan kolom garam PD-10 (diproduksi oleh American Biosciences), dan buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7, 8) diseimbangkan pada 4 ° C.
- Menekan B50 mm Tris-HCl, pH 7, 8
- Jumlah sampel (4 mL) dikurangi menjadi 1 mL menggunakan konsentrat putaran cu t-30 kDa (Sartorius). Simpan sampel dengan cepat membeku dengan tabung pencegahan freezer dari tangki nitrogen aseton-kering atau cair, kemudian dibekukan pada 70 ° C, atau menambahkan gliserol ke konsentrasi akhir 50%(v/v), simpan pada 20 ° C.
- Protokol standar dilakukan pada pelat mikrotiter.
- Reagen pigmen (konsentrat reagen pewarna protein, katalog NO: 500-0006, bio-radtm) disiapkan dengan diencerkan 1 bagian dari konsentrasi reagen pigmen dalam air suling ganda. Reagen pengenceran ini dapat digunakan selama sekitar 2 minggu ketika disimpan pada suhu kamar. Delapan pengencer protein standar (0, 00, 0, 05, 0, 15, 0, 25, 0, 40, 0, 50 mg/mL) disiapkan. Larutan protein diukur dalam triple triple. Setiap solusi standar dan solusi sampel (10⁇ L) disalurkan ke pelat mikro titer yang terpisah. Reagen pigmen yang diencerkan (200⁇ L) ditambahkan ke masin g-masing sumur.
- Mixer microplate sepenuhnya dicampur dengan sampel dan reagen, dan pada suhu kamar diinkubasi setidaknya selama 5 menit. Penyerapan 595 nm diukur menggunakan pemimpin pelat titer mikro (spektrum max plustm, perangkat molekuler). Konsentrasi protein selama sampel dihitung menggunakan zat standar menggunakan garis kalibrasi yang dibuat.
- Pengukuran spektroskopi konsentrasi protein FDH dilakukan dengan menggunakan nilai laporan 1, 32⁇ 10 5 m⁇ 1 dalam 280 nm PSEFDH.
- Buffer natrium fosfat (0, 1m, pH7. 0) dari 950 liter ditambahkan ke kuarsa cubet. Absorbansi diukur pada 280 nm.
- Sampel protein BCENFDH1 dan BSPFDH2 diperkenalkan sebagai sumber ion sebagai kebocoran HPLC. Electros Sprayonized (Mode Positif) memperoleh beberapa puncak protein, dan massa protein yang sebenarnya dihitung menggunakan perangkat lunak Maxlynx menggunakan algoritma dekorbal Maxent.
- BCENFDH1, yang tidak mengandung metionin N-terminal, adalah 42462 da. Demikian pula, BSPFDH2, yang tidak mengandung metionin N-terminal, adalah 42466 da.
- LC-MS Terhubung Micromass LCT (ESI (+) -TOF-MS) dan Air Alliance 2790 HPLC menggunakan kolom Phenomenex Jupiter C4 (240 cm⁇ 4, 6 mm⁇ 5 mikrom). Lihat Gambar. 15 untuk analisis LCMS BCENFDH1 dan BSPFDH2.
- Gradien diprogram sebagai berikut: 16 menit setelah 95%A (3 menit isokratik) hingga 100%B, 2 menit setelah 2 menit.
- Gambar 5 dan 6 menunjukkan BcenFDH1 (Bsp184FDH) (Gambar 5 (a) kromatogram (b) spektrum keadaan muatan ganda ‘RAW’ (c) spektrum dekonvolusi MaxEnt) dan BspFDH2 (Bsp383FDH) (Gambar 6 (a) kromatogram (b) Spektrometri massa hasil spektrum ‘RAW’ keadaan muatan ganda (c) spektrum dekonvolusi MaxEnt )) ditampilkan.
- Oksidasi asam format yang dikatalisis BcenFDH1 (Bsp184FDH) dan BspFDH2 (Bsp383FDH) menjadi CO2 dipantau dengan spektrofotometri UV/Vis dalam format pelat 96 sumur.
- Delapan larutan asam format (0–200 mM) dibuat dengan mengencerkan secara serial larutan stok natrium format 0, 5 M dalam buffer natrium fosfat 0, 1 M (pH 7, 0). Dari rangkaian larutan ini, 170⁇L dipindahkan ke sumur pada pelat 96 sumur.
- Laju oksidasi asam format dihitung menggunakan koefisien pemadaman sebesar 3, 38 mM ⁇ 1 (untuk 200 ⁇ L) yang ditentukan dengan menggunakan standar NADH.
- Nilai K m dan V max ditentukan dengan regresi nonlinier ke persamaan Michaelis-Menten (Persamaan 1 di bawah) menggunakan Origin v7 (Microcal Software Inc.).
- Setelah itu, plat tersebut segera dipasang pada plate reader. Setelah mengocok pelat selama 5 detik agar tercampur rata, pengukuran berdasarkan waktu dicatat setiap 15 detik selama 10 menit.
- Laju oksidasi asam format dihitung menggunakan koefisien pemadaman sebesar 3, 38 mM ⁇ 1 (untuk 200 ⁇ L) yang ditentukan dengan menggunakan standar NADH.
- Nilai K m dan nilai V max ditentukan dengan regresi nonlinier menggunakan persamaan Michaelis-Menten seperti yang dijelaskan di atas.
- Penghambatan oksidasi format oleh Bsp383FDH atau Bsp184FDH dilakukan dengan adanya inhibitor potensial berikut: NaN3, NaNO2, KNO3, KNO2, KCN, dan iodoacetamide ditambahkan pada konsentrasi 5 dan 20 mM.
- 10❓L enzim, Bsp383FDH (0, 022 mg/mL) atau Bsp184FDH (0, 020 mg/mL), ditambahkan ke buffer natrium fosfat (50 (mM, pH 7, 0) selama 5 menit pada suhu kamar.
- Kemudian, NADP ditambahkan ke konsentrasi akhir 5mM untuk memulai reaksi oksidasi asam format. Absorbansi pada 340 nm akibat pembentukan NADPH dipantau secara spektrofotometri menggunakan pembaca pelat mikrotiter. Absorbansi dicatat pada interval 10 detik selama 10 menit. Aktivitas awal dihitung menggunakan bagian linier dari pengukuran awal menggunakan setidaknya 20 titik data dan digunakan langsung sebagai nilai aktivitas relatif. Eksperimen kontrol juga dilakukan tanpa adanya enzim.
- Gbr.
- Gbr.
- BCENFDH1 BSP184FDH
- BSPFDH2 BSP383FDH
- Gbr. (I) Sodium sodium phosphate buffer (50 mm) for pH5. 85 to 8. 0 sodium phosphate buffer (50 mm) for pH 5. 85 to 8. 0 sodium sodium phosphate sodium phosphate sodium phosphate sodium phosphate sodium phosphate sodium phosphate sodium sodium phosphate sodium phosphate is continuously mixed Disiapkan. Dari seri ini, 170⁇ L dipindahkan ke 96 sumur sumur sumur.
- Gbr.
- Stabilitas termal berbasis waktu dari bcenfdh1 tipe liar yang dimurnikan (BSP184FDH) dan BSPFDH2 (BSP383FDH) juga diperiksa selama 48 jam pada 60 ° C dan 70 ° C. selama 48 jam. Sampel diputar untuk waktu yang singkat sebelum digunakan dan menghilangkan sedimen. BCENFDH1 yang diobati dengan panas dan BSPFDH2 ditambahkan ke masin g-masing sumur dengan 10⁇ L, dan keseimbangan adalah keseimbangan pada 30 ° C selama 3 menit.
- Gen Candida Methylica FDH diperkenalkan di Tempat 195 dan Gen Burkholderia FDH k e-223.
- Oligonukleotida sintetis berikut dirancang untuk memperkenalkan mutasi yang diinginkan:
- D195Q-CMETFDH (F) SEQ ID NO: 24 5-GaattattacCcctttacccccccccen.- (r) seq ID No: 25’ggtaaaagctttgatata ctgtatattc-3 ‘: (f) no: 26 5′-gctgcacacacgg GATCGGG GATCCGG NO: 26 5′-GCTGCGGG GATCGGG R) SEQ ID NO: 27 5′-CGAGCCGGGCGCGGCG ATC CGTGTAGTGCAGC-3′- (R) SEQ ID NO: 27 5’-CGAGCCGGGTGGCGGCG
- Uji kristalisasi dilakukan pada 96 format sumur menggunakan layar protein terbatas yang disebut S O-S o-disebut, layar kristal II, dan layar PEG/ion (Hampton Research). Sodium sulfat dan 11, 5 % PEG3350 memberikan bentuk kristal yang paling diinginkan dalam kondisi yang dihasilkan kristal. Optimalisasi dilakukan dengan menggunakan metode drip uap uap 2 4-wel l-form (cryschem, Hampton Research, USA). Baki optimasi telah diatur untuk mutan asli dan Q223D BSP383FDH di bawah kondisi asli 14 mg mL⁇ 1 dan larutan ibu terakhir 170 mM natrium sulfat dan 11, 5% PEG 3350. Protein: dijatuhkan dalam rasio jus ibu = 1: 1, dan kapasitas akhir diatur ke 2 l. Dua kristal tulang tumbuh lebih dari 2 hingga 12 hari.
- BSP383FDH-NADP +dan Q223D BSP383FDH-NAD +Kristal kompleks diperoleh dengan menambahkan 5 hingga 20 mm fermentasi ke jus ibu sebelum menetes. Jus ibu utama adalah 0, 5 mL.
- Kristal kompleks membutuhkan waktu dua hingga 12 hari untuk tumbuh, dan mereka memiliki bentuk yang sama dengan kristal asli. Semua kristal dibekukan dengan larutan 20%etilen glikol ke larutan WED sebagai zat pelindung beku sebelum secara instan membeku dengan nitrogen cair.
- Selain itu, dataset asli dari ID 14-4 (ESRF) hingga 1, 5⁇ pada akhir detektor kuadrat dikumpulkan. Data diproses menggunakan HKL2000 (Otwinowski, Z. & amp; Minor, W. Macromolekul Crystalllography, PT A 276, 307-326 (1997)).
- BSP383FDH-NADP 2. 5⁇ -S-Decomposer Defraction Data dikumpulkan dengan balok ID29 (ESRF).
- Koordinat asli BSP383FDH yang disempurnakan digunakan sebagai model substitusi molekuler phaser, dan kompleks BSP383FDH-NADP diselesaikan.
- Koordinat NADP + diperoleh dengan menggunakan Prodrg (Schuttelkopf, A. W. & amp; Aalten, D. M. F. Acta Crystallographica Bagian D, 1355-1363 (2004)) dan didistribusikan padat.
- Data kompleks BSP383FDH-NADP-format/azide dikumpulkan dari kristal tunggal ke 2, 0⁇ dengan beamline IO4 (Diamond, Oxford).
- Q223D BSP383FDH-NAD + Data kompleks dikumpulkan hingga 2, 0⁇ dengan ID14-4 (ESRF).
- Karena kedua dataset skala adalah tipe yang sama dengan data asli, model asli digunakan sebagai model awal presisi.
- Kamus stereoskopik NAD dan NADP diperoleh dari Prodrg dan Hic-up (Schuttelkopf, A. W. & amp; Leywegt, G. J. & Amp; Jones, T. A. Databas dalam kristalografi protein. KELEYWEGT, G. J. & AMP; Jones, T. A. Data-basis CRYROGROGUNG dalam CRITOBACH CRYROPH, CRITINE.
- Piring disegel dengan jenis segel transparan dan ditempatkan di rak pada suhu kamar. Kristal dua tulang tumbuh selama 2-12 hari. Pertumbuhan kristal dipantau dengan mikroskop (Nikon SMZ1000), dan gambar tersebut direkam dengan kamera bersih digital (Nikon, DN100). Pertumbuhan kristal diselidiki dan dicatat pada berbagai interval waktu. Sebelum mengumpulkan data, kristal FDH adalah keseimbangan pertama dengan solusi sumur dan kemudian dibekukan. Kristal FDH sebelum keseimbangan dipindahkan ke larutan pelindung beku 0, 1 mL, bersama dengan larutan sumur sekitar 5-10⁇ L. Larutan pelindung beku mengandung 170 mM natrium sulfat, 11, 5%PEG3350, dan 20%etilen glikol. Segera setelah gerakan pertama, kristal dijatuhkan menggunakan loop Clio yang melekat pada tutup stainless steel dan dibekukan dalam nitrogen cair.
- Aktivitas enzim dari 103 koloni Q223X-BSP383 FDH skrining dilakukan sebagai berikut.
- Mutasi yang diperkenalkan dilakukan di Genscript Ltd.
- Campuran plasmid mutan dan plasmid WT diubah menjadi sel kompeten BL21 (DE3) untuk ekspresi protein.
- Koloni yang dibudidayakan semalam diinokulasi dengan 96 Wel l-pepwell Plate (Abgene) dalam solusi kultur 1ML dari media autoindouction (diproduksi oleh Novagen), yang menambahkan ampisilin (konsentrasi akhir 100⁇ L/mL). Lempeng ditutupi dengan film yang dipenuhi gas (Abgene), dan gegar otak yang dibudidayakan semalaman pada 300 rpm pada suhu 37 ° C. Campuran 50%gliserol 50. l yang mensterilkan sampel 100 ❓ Lotted semalam disimpan dan disimpan pada 80 ° C. Budaya yang tersisa dilarutkan pada 300 rpm pada suhu kamar selama 30 menit menggunakan reagen campuran master bugbuster 50 ❓ L (dibuat oleh Novagen).
- Bugbuster Master Mix mengulas Novagen
- Sebagai kontrol negatif, sel bakteri Timur yang memegang vektor ekspresi BSP393 FDH dan PET 23B digunakan. Media yang dipandu sendiri digunakan untuk menghindari penambahan IPTG dan pengukuran OD 600. Campuran bugaster ove r-counter yang digunakan untuk melarutkan sel itu tidak mempengaruhi skrining aktivitas enzim. Dianggap bahwa aktivitas tidak diperlukan untuk membakukan sel OD 600.
- Urutan DNA dilakukan dengan memilih sampel variabel BSP383FDH Vmax dengan 20 ㎤ABS/ menit atau lebih.
- Data GC-MS adalah mode pemindaian penuh (M/Z50-300) menggunakan kolom BPX-5 (0, 25 mm⁇ 15 m, ketebalan membran 0, 25um) dari sistem GCT (GC: Agilent G890 Series, MS: Micromass) . Program GC berikut: 80 ° C (tahan 2 menit), 80-280 ° C (10 ° C/ menit), 280 ° C (tahan 5 menit).
- Tabel E menunjukkan hasilnya.
- TTN terbaik dari NADP +dan enzim dalam reaksi lengkap adalah reaksi E-3. Dalam kondisi ini, baik NADP+TTN dan enzim TTN telah dicapai dalam kisaran efisien 104-10 5.
- Dalam kondisi ini, baik NADP+TTN dan enzim TTN efisien. Dibandingkan dengan E-3, omset enzim lebih tinggi, tetapi omset NADP+rendah.
Landscapes
- Ilmu Hidup / Ilmu Bumi (Area)
- Kimia / Ilmu Material (Area)
- Ilmu Kesehatan / Kedokteran (Area)
- Ilmu Genetik / Genome (Area)
- Kimia Organik (Area)
- Teknik & Ilmu Komputer (Area)
- Format Bio Infomatics Keminin (Area)
- Hewan (area)
- Sains dan Teknologi Kayu (Area)
- Biologi Molekuler (Area)
- Microbean (Area)
- Bioteknologi (Area)
- Teknologi Kedokteran Biologis (Area)
- Biokimia (area)
- Teknik Umum / Ilmu Komputer (Area)
- Kesehatan / Kedokteran Umum (Area)
- Kimia Farmasi (Area)
- Enzim dan modifikasi (area)
Abstract
Penemuan ini memberikan polipeptida FDH terisolasi dengan polipeptida dhidrogenase (FDH) yang terisolasi khusus untuk NADP +, dan loop pengenalan ribosa adenin yang terdiri dari asam amino besar pertama dan asam amino kedua. Asam ditempatkan secara spasial sehingga asam amino kedua dapat berikatan dengan gugus fosfat. Selain itu, ini adalah mutan dari polipeptida FDH spesifik + spesifik, setidaknya satu posisi untuk mengubah struktur polipeptida tiga dimensi dari loop pengenalan ribosa adenin sehingga loop pengenalan ribosa adenin diakui. Polipeptida dari penemuan ini dapat digunakan dalam konversi dari NADP + ke NADP atau konversi dari Bad + ke Nash.
Description
Penemuan ini menyediakan enzim FDH baru, terutama enzim FDH NADPH atau NAD H-spesifik. Penemuan ini juga menyediakan penggunaan enzim baru ini dalam sistem katalitik untuk pemutaran NADPH atau NADH. Penemuan ini juga berkaitan dengan penggunaan struktur kristal enzim baru dan penggunaan struktur ini.
Enzim dapat bertindak sangat efisien dalam sistem air, sehingga menarik sebagai reagen sintetis yang ramah lingkungan. Namun, banyak jenis katalis biologis tidak digunakan secara memadai dan membutuhkan koenzim yang mahal, sehingga penggunaan bahan kimia yang ditambahkan dengan nilai tinggi untuk sintesis enzim skala besar seringkali terbatas. Enzim reduktur menyumbang sekitar 25 % dari enzim yang diketahui semua yang diketahui, dan kebanyakan dari mereka bergantung pada dua nikotin amida NADH atau NADPH yang dikonservasi. (Liu, W. et al., Kemajuan Bioteknologi 25, 369-384 (2007)).
Enzim diphidrogenase (FDH) dapat meregenerasi redoksyshemer teroksidasi NADH di tempat. Dengan demikian, FDH adalah kepentingan komersial dalam katalis regeneratif dari coalecast tip e-tipe dalam sintesis senyawa yang berharga dan konversi biologis. Pemutaran dari NAD +ke NADH melalui FDH dianggap “standar emas” untuk reederasi (Liu, W. et al., 2007), dan NAD (h memiliki (h) telah memungkinkan penggunaan enzim teroksidasi merah yang efisien. Sebagai contoh industri regenerasi dari NAD+ke NADH melalui FDH, produksi Tert-L-leusin dan asam amino yang tidak diproduksi lainnya terkenal dengan produksi obat-obatan.
Semua dehidrogenase tipe satwa liar yang diketahui adalah spesifik NADH, memiliki NADH yang lebih kuat daripada NADPH, dan tidak memiliki kemampuan untuk mengkatalisasi reaksi dengan NADP +(Seelbach, K. et al. Letteres Tetrahedron 37, 1377-80 (1996); Tishkov , v. I. et al., Bioteknologi dan Bioengineering 64, 187-194 (1999).
Karena lebih dari 80% reduksi biokatalitik menggunakan NADPH dibandingkan NADH, kurangnya metode yang sebanding untuk regenerasi koenzim NADP+ dan NADPH yang efisien pada dasarnya melemahkan sintesis kimia “hijau” yang efisien. Proses-proses ini mencakup spektrum lebih dari 300 jenis reaksi yang diketahui dan digunakan berulang kali (Woodyer, R., dkk. Jika ditemukan, hal ini akan melepaskan sumber daya kimia berharga yang belum dimanfaatkan.
Minat mendasar yang luas pada spesifisitas dehidrogenase (Hall, N. et al., Microbiology 146, 1399-1406 (2000); (Lamzin, V. S. et al., Journal of Molecular Biology 236, 759-785 (1994); Lamzin , V. S. et al., Current Opinion in Structural Biology 5, 830-836 (1995)), tidak ada FDH yang diketahui lebih menyukai NADPH.
Menurut aspek pertama, penemuan ini menyediakan polipeptida format dehidrogenase (FDH) terisolasi yang spesifik terhadap NADPH.
Istilah spesifik NADPH dan spesifik NADP+ digunakan secara bergantian di sini untuk merujuk pada enzim FDH yang mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH. Demikian pula, istilah spesifik NAD+H dan spesifik NAD+ digunakan secara bergantian di sini untuk merujuk pada enzim FDH yang mengkatalisis konversi NAD+ menjadi NADH.
Polipeptida FDH didefinisikan sebagai spesifik NADPH jika kemampuannya untuk meregenerasi NADPH dari NADP+ lebih besar daripada kemampuannya untuk meregenerasi NADH dari NAD+. Polipeptida FDH dapat meregenerasi NADPH dan NADH, namun agar spesifik pada salah satu polipeptida, polipeptida tersebut harus mempunyai kemampuan yang ditingkatkan untuk meregenerasi salah satu polipeptida tersebut. Lebih disukai, polipeptida FDH spesifik NADP+ menurut penemuan ini menunjukkan preferensi untuk NADP+ yang setidaknya 10 6 kali lebih besar dibandingkan dengan FDH spesifik NAD+ yang diketahui. Lebih disukai, protein FDH menurut penemuan yang khusus untuk NADPH lebih dari 10 kali, lebih disukai lebih dari 20 kali, lebih disukai 25 kali lebih spesifik untuk (kcat/Km)NADP+/(kcat/Km)NAD+ NADP+ atas NAD+ yang lebih besar, lebih disukai lebih besar dari 30 kali.
Menurut aspek lain, penemuan ini menyediakan bahwa loop pengenalan adenin ribosa terdiri dari asam amino besar pertama dan asam amino kedua, asam amino pertama dan asam amino kedua terikat pada gugus fosfat yang ditata secara spasial sedemikian rupa sehingga dapat diisolasi.
Lebih disukai, asam fosfat adalah bagian dari NADP +. Lebih disukai, polipeptida mengenali NADP +dan dapat mengkatalisasi konversi ke NADPH. Polipeptida juga dapat mengkatalisasi konversi dari NAD +ke NADH. Lebih disukai, polipeptida lebih suka NADP +lebih dari NAD +.
Lebih disukai, asam amino besar pertama adalah asam amino dengan volume fandelwaarus sekitar 110anĝ3 atau lebih. Asam amino besar pertama dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin. Asam amino besar juga dapat dipilih oleh arginin, histidin, lisin dan triptofan.
Lebih disukai, asam amino kedua dapat membentuk ikatan asam fosfat atau hidrogen atau ikatan ionik. Lebih disukai, asam amino kedua memiliki muatan positif. Asam amino kedua dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari arginin, lidin, asam glutamat, glutamin dan asam aspartat.
Lebih disukai, asam amino pertama adalah glutamin atau tirosin. Lebih disukai, asam amino kedua adalah arginin atau lidin. Lebih disukai, asam amino pertama adalah glutamin, dan asam amino kedua adalah arginin.
Lebih disukai, asam amino pertama dan asam amino kedua tidak lebih dari 20 asam amino dalam urutan asam amino primer dari polipeptida FDH. Lebih disukai, asam amino pertama dan asam amino kedua tidak lebih dari 10 asam amino dalam urutan asam amino primer dari polipeptida FDH. Asam amino pertama dan asam amino kedua mungkin berdekatan dengan urutan asam amino primer dari fdh polipeptida.
Lebih disukai, asam amino pertama dan asam amino kedua tidak lebih dari 10 holipeptida dalam polipeptida FDH terlipat. Lebih disukai, asam amino pertama dan asam amino kedua tidak sekitar 9, 8, 7, 6, 5, 5, 3, 3 atau 2 Onglum; bukan sekitar 4 haungstromes atau lebih.
Lebih disukai, asam amino pertama dan asam amino kedua terdiri dari protein terlipat, sehingga loop pengenalan ribosa adenosin mengandung asam fosfat NADP +. Ini berbeda dengan enzim FDH NAD +spesifik yang diketahui di mana struktur loop pengenalan ribosa adenin menghambat pengakuan NADP +.
Loop pengenalan ribosa adenin lebih disukai kurang dari 20 asam amino, lebih disukai 15 asam amino, dan kurang lebih disukai 10 asam amino. Loop pengenalan ribosa adenin dalam enzim FDH baru terdiri dari seq ID yang disukai No: 1 atau 2 asam amino 222 hingga 228, lebih disukai asam amino 222 dan 227. Seni seni dapat dengan mudah mengidentifikasi loop pengenalan adenin ribos pada enzim FDH lain berdasarkan urutan asam amino primer dan / atau tiga dimensi struktural homolog.
Menurut perwujudan lebih lanjut, penemuan ini adalah polipeptida yang terisolasi yang mengandung loop pengenalan ribosa adenin, dan urutan asam amino dari loop pengenalan ribosa adenin adalah seq ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Adenin Ribose Range. dengan setidaknya 50 % atau lebih identitas urutan untuk array loop.
Lebih disukai, loop pengenalan ribosa polipeptida setidaknya 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 95 %atau lebih, dengan ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Loop pengenalan ribosa adenin Identitas array. Lebih disukai, polipeptida memiliki loop pengenalan ribosa adenin yang sama dengan ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Loop Pengenalan Ribose Adenin.
Loop pengenalan ribosa adenin lebih disukai seq ID NO: 1 atau 2 asam amino 222 hingga 228, dan lebih disukai loop pengenalan ribosa adenin terdiri dari SEQ ID NO: 1 atau 2 asam amino 222 hingga 227.
Lebih disukai, polipeptida adalah enzim FDH.
Persen identitas array didefinisikan sebagai rasio asam amino dalam urutan, yang sama dengan asam amino yang disediakan dalam pengaturan setelah array diatur, celah diperkenalkan sesuai kebutuhan, urutan dimaksimalkan. Penyelarasan untuk menentukan persentase identitas array dapat dicapai dalam banyak hal yang diketahui oleh seni, misalnya, bagaimana menggunakan BLAST (Pusat Nasional untuk Informasi Bioteknologi Alat Pencarian Alignment Lokal). Fluktuasi persentase yang identik dapat, misalnya, dalam substitusi asam amino, penyisipan, atau penghapusan. Substitusi asam amino pada dasarnya konservatif karena asam amino yang diganti memiliki sifat struktural dan / atau kimia yang sama, misalnya, penggantian leusin dengan isoleusin.
Menurut perwujudan lebih lanjut, penemuan ini memberikan polipeptida terisolasi yang terdiri dari urutan asam amino dengan array SEQ ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 dan setidaknya 50 % atau lebih.
Lebih disukai, polipeptida memiliki ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Urutan dan setidaknya sekitar 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %atau lebih, dan lebih disukai. : 1 atau SEQ ID NO: 2 Urutan dan setidaknya 80 % dari identitas urutan, dan lebih disukai polipeptida adalah SEQ ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2. Ia memiliki urutan asam amino yang sama dengan array.
Lebih disukai, polipeptida adalah enzim FDH.
Lebih disukai, polipeptida sesuai dengan penemuan ini mengandung asam amino besar dalam posisi yang sesuai dengan ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Asam Amino 223. Lebih disukai, asam amino besar adalah asam amino dengan volume fundelwars sekitar 110anĝ3 atau lebih. Asam amino besar dapat dipilih dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin. Asam amino besar juga dapat dipilih oleh arginin, histidin, lisin dan triptofan.
Lebih disukai, polipeptida sesuai dengan penemuan ini mengandung asam amino yang dapat membentuk fosfat dan / atau ion yang diondoksikan pada posisi yang sesuai dengan ID SEQ NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Asam Amino 224. Lebih disukai, asam amino memiliki muatan positif. Asam amino kedua dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari arginin, lidin, asam glutamat, glutamin dan asam aspartat.
SEQ ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 Asam amino yang kompatibel dengan asam amino 223 atau 224 dapat dengan mudah ditentukan oleh polipeptida FDH lainnya dengan mengatur array;
Polipeptida menurut penemuan ini memiliki salah satu urutan SEQ ID NO: 3 hingga 19 dan setidaknya 50 %. Polipeptida memiliki satu atau lebih ID SEQ No: 3 hingga 19 array, setidaknya 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, dan 95 %atau lebih.
Polipeptida mungkin merupakan polipeptida yang ada secara alami. Atau, polipeptida mungkin merupakan modifikasi polipeptida alami.
Misalnya, protein FDH dapat berupa enzim FDH alami dari Burkholderia sp., yang dapat dikodekan oleh gen dari Burkholderia cenocepacia PC184. Protein ini disebut BcenFDH1 atau Bsp184FDH (Seq ID No:2) dan dapat dikodekan oleh gen Bcenfdh1. Alternatifnya, protein FDH dapat dikodekan oleh gen dari Burkholderia sp 383. Protein ini disebut BspFDH2 atau Bsp383FDH (Seq ID No:1) dan dapat dikodekan oleh gen Bspfdh2.
Menurut aspek selanjutnya, penemuan ini menghasilkan polinukleotida yang mengkode polipeptida dari penemuan ini. Polinukleotida dapat dimasukkan dalam vektor ekspresi rekombinan, dimana polinukleotida dapat dihubungkan secara operasional ke promotor.
Invensi ini juga dapat menyediakan sel-sel yang mengandung polinukleotida atau vektor ekspresi sesuai dengan invensi ini.
Menurut aspek lain, penemuan ini menyediakan varian polipeptida FDH spesifik NAD+, dimana asam amino dari loop pengenalan adenin ribosa yang sesuai dengan asam amino 223 dari Seq ID No: 1 atau 2 adalah asam amino besar dan polipeptida mengenali NADP+ . Lebih disukai, asam amino besar adalah asam amino dengan volume van der Waals sekitar 110 Anĝ3 atau lebih. Asam amino besar dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin. Asam amino besar juga dapat dipilih dari arginin, histidin, lisin, dan triptofan.
Lebih disukai, varian polipeptida adalah polipeptida FDH yang telah dimodifikasi dan diketahui.
Lebih disukai, asam amino dalam varian polipeptida FDH spesifik NAD+ yang sesuai dengan asam amino 224 dari SEQ ID NO:1 atau SEQ ID NO:2 mampu membentuk ikatan H dan/atau ikatan ionik dengan fosfat. Lebih disukai asam amino yang mempunyai muatan positif. Asam amino dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari arginin, lisin, asam glutamat, glutamin dan asam aspartat.
Lebih disukai, asam amino pada posisi yang sesuai dengan posisi 223 dari Seq ID No:1 atau Seq ID No:2 adalah glutamin, dan asam amino pada posisi yang sesuai dengan posisi 224 dari Seq ID No:1 atau Seq ID No:2 adalah arginin.
Lebih disukai, varian polipeptida FDH spesifik NAD+ mengenali NAD+ dan NADP+. Variannya mungkin spesifik untuk NADP+. Lebih disukai, varian tersebut mengenali NADP + lebih baik daripada polipeptida FDH spesifik NAD + yang tidak dimodifikasi.
Menurut perwujudan lain, penemuan ini memberikan mutan polipeptida FDH spesifik NAD +, dan di sini, adenin bose dapat dikenali oleh loop pengenalan ribosa adenin. dari loop pengakuan. Lebih disukai, mutan polipeptida FDH spesifik NAD + dapat membentuk ikatan H dan / atau ionik dengan gugus fosfat.
Lebih disukai, loop pengenalan ribosa adenin terdiri dari asam amino besar pertama dan asam amino kedua yang dapat membentuk gugus asam fosfat dan / / atau ikatan ionik. Lebih disukai, setidaknya satu atau asam amino pertama atau kedua tidak ada di polipeptida FDH spesifik NAD + yang tidak dikutip.
Lebih disukai, asam amino besar pertama adalah asam amino dengan volume fandelwaarus sekitar 110anĝ3 atau lebih. Asam amino besar pertama dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin. Asam amino besar juga dapat dipilih oleh arginin, histidin, lisin dan triptofan.
Lebih disukai, asam amino kedua dapat membentuk ikatan asam fosfat atau hidrogen atau ikatan ionik. Lebih disukai, asam amino kedua memiliki muatan positif. Asam amino kedua dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari arginin, lidin, asam glutamat, glutamin dan asam aspartat.
Lebih disukai, polipeptida mutan memiliki kemampuan yang lebih baik untuk mengkatalisasi konversi dari NADP + ke NADPH dibandingkan dengan enzim unreal. Lebih disukai, kemampuan untuk mengkatalisasi konversi dari NADP + ke NADPH setidaknya 10 kali, lebih disukai 100 kali, lebih disukai, dan setidaknya 1000 kali dibandingkan dengan polipeptida yang tidak bermutasi. Lebih disukai, polipeptida mutan adalah NADP + spesifik.
Menurut perwujudan lain, penemuan ini menyediakan metode untuk mempersiapkan polipeptida FDH yang mengenali NADP +, yang mencakup yang berikut:
-
- A.
- b. SEQ ID NO: 1 atau SEQ ID NO: 2 AMINO ACID 223, memilih residu asam amino dalam polipeptida induk;
- Dalam posisi yang dipilih dalam C. B), kami menyediakan asam amino yang menggantikan asam amino yang dihasilkan oleh). Lebih disukai, asam amino alternatif adalah asam amino besar, lebih disukai glutamin;
- d. membuat polipeptida yang mempunyai urutan c);
- e. Pilih salah satu yang dapat mengenali NADP+ dari antara polipeptida yang dibuat pada d).
Sebaiknya, pada langkah (a), polipeptida mempunyai Seq ID No: 3 sampai 19.
Lebih disukai, polipeptida yang dipilih dalam (e) paling sedikit 10 kali lebih efisien dalam mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH dibandingkan polipeptida dalam (a), sebaiknya paling sedikit 100 kali lebih efisien, lebih disukai paling sedikit 1000 kali lebih efisien daripada polipeptida dalam (a). polipeptida di (a). Lebih disukai, polipeptida (e) spesifik terhadap NADP+.
Menurut perwujudan lain, penemuan ini menyediakan metode untuk mempersiapkan polipeptida FDH yang mengenali NADP +, yang mencakup yang berikut:
-
- a. Menyediakan polipeptida FDH induk yang spesifik untuk NAD+, yang mana polipeptida induk FDH sebaiknya mempunyai rangkaian asam amino yang mempunyai sekurang-kurangnya 50% identitas rangkaian dengan satu atau lebih rangkaian Seq ID Nos: 3 sampai 19. memiliki;
- b. Identifikasi loop pengenalan adenin ribosa dari polipeptida FDH induk;
- c. Mengubah paling sedikit satu residu asam amino pada loop pengenalan adenin ribosa induk sedemikian rupa sehingga loop tersebut dapat mengenali fosfat NADP+;
- d. membuat polipeptida yang mempunyai urutan c);
- e. Pilih salah satu yang dapat mengenali NADP+ dari antara polipeptida yang dibuat pada d).
Lebih disukai, polipeptida (e) mampu mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH.
Lebih disukai, polipeptida (e) paling sedikit 10 kali lebih baik, lebih disukai paling sedikit 100 kali lebih baik, lebih disukai paling sedikit 1000 kali lebih baik dalam mengenali NADP+ daripada polipeptida induk. Lebih disukai, polipeptida (e) mampu mengenali NAD+ dan NADP+ dan mengkatalisis konversinya masing-masing menjadi NADH dan NADPH. Lebih disukai, polipeptida (e) spesifik terhadap NADP+.
Lebih disukai, paling tidak satu asam amino yang dimasukkan dalam (c) adalah asam amino besar. Lebih disukai, asam amino besar adalah asam amino dengan volume van der Waals sekitar 110 Anĝ3 atau lebih. Asam amino besar dapat dipilih dari kelompok yang terdiri dari glutamin, tirosin, fenilalanin, metionin, isoleusin dan leusin. Asam amino besar juga dapat dipilih dari arginin, histidin, lisin, dan triptofan. Lebih disukai, asam amino besar mengubah konformasi loop pengenalan adenin ribosa dari enzim induk FDH, memungkinkan enzim mengenali NADP+ dan mengkatalisis konversinya menjadi NADPH.
Menurut aspek lain lagi, penemuan ini menyediakan polipeptida yang dihasilkan dengan metode apa pun dalam penemuan ini. Lebih disukai, polipeptida yang dihasilkan mampu mengkatalisis konversi NADP+ menjadi NADPH.
Lebih disukai, enzim dehidrogenase format spesifik NADPH (FDH) baru dari penemuan ini tidak hanya menunjukkan aktivitas dehidrogenase format yang kuat, namun juga menunjukkan preferensi untuk koenzim NADP + dibandingkan NAD +. Dari struktur kristal FDH baru ini, dasar struktural untuk pengenalan koenzim format dehidrogenase ditentukan untuk pertama kalinya. Pada tingkat struktural keseluruhan, protein FDH spesifik NADP+ yang baru mirip dengan enzim FDH spesifik NAD+ yang diketahui, dan sebagian besar interaksinya sama dengan yang diamati untuk FDH spesifik NAD+. Namun, terdapat perbedaan penting dan penting dalam hal ini loop pengenalan adenin-ribosa. Pengenalan fosforibosida dalam enzim FDH spesifik NADP+ dipengaruhi oleh asam amino besar seperti glutamin, berbeda dengan asam amino aspartat kecil yang ditemukan pada posisi setara dengan banyak enzim FDH spesifik NAD+ yang diketahui.
Selektivitas koenzim baru yang ditunjukkan oleh FDH spesifik NADP+ dari penemuan ini memungkinkan regenerasi NADPH in situ. Oleh karena itu, sintesis kimia “hijau” yang efisien menggunakan enzim yang bergantung pada NADPH kini dapat dilakukan untuk pertama kalinya, termasuk namun tidak terbatas pada sintesis asam amino tidak alami, alkohol kiral, dan poliol.
Protein FDH baru, Seq ID No: 1 dan 2, yang dikodekan oleh strain Burkholderia, keduanya menunjukkan aktivitas FDH yang kuat dan masing-masing memiliki preferensi koenzim yang kuat untuk NADP + (kcat/Km) NADP + /( kcat/Km) NAD+ adalah 73 untuk BcenFDH1 dan 39 untuk BspFDH2, dan perbedaan preferensi koenzim NADP + sekitar 10, 5 kali, misalnya 10, 6 kali lipat dari CmetFDH (FDH) 10, 6 kali lebih besar dari
Baik BcenFDH1 (Bsp184FDH) dan BspFDH2 (Bsp383FDH) memiliki residu glutamin pada posisi 223 dari loop pengenalan adenin-ribosa (lihat Gambar 18), yang terlibat dalam pengenalan NADP +. Hal ini berbeda dengan enzim Burkholderia FDH spesifik NAD +, yang memiliki aspartat pada posisi yang sesuai dengan posisi 223 BcenFDH1 dan BspFDH2. Gln223 adalah elemen pengenalan penting untuk NADP + fosfat, dan BspFDH2 dan BcenFDH1 spesifik untuk NADP + fosforibosa.
BCENFDH1 dan BSPFDH2 adalah contoh FDH liar yang secara alami lebih suka NADP +daripada NAD +. Meskipun lebih dari 200 upaya untuk mengubah rasa penguatan FDH spesifik NADH selama lebih dari 30 tahun, hanya sejumlah kecil perbaikan yang telah ditingkatkan, yang juga terbatas. 4).
Selain adenin untuk enzim FDH alami dengan glutamin pada loop pengenalan ribosa, enzim FDH lainnya seperti enzim FDH spesifik NAD +juga dapat dioperasikan / dimodifikasi sehingga mereka menjadi spesifik NADP +. Ini dapat dicapai dengan memperkenalkan asam amino besar seperti glutamin dalam loop pengenalan adenin-ribosa dalam posisi yang sesuai dengan tempat ke-223 BCENFDH1 dan BSPFDH2. Protein spesifik NAD +yang diketahui memiliki asam asparagat dalam loop pengenalan adenin-Ribos di posisi yang sesuai dengan tempat ke-223 BCENFDH1 dan BSPFDH2. Dengan mengubah asam asparagat ini menjadi glutamin, perubahan dramatis dari NAD +ke NADP +diamati.
Glutamin atau asam amino besar lainnya dapat diperkenalkan oleh rekayasa genetika; Dalam enzim FDH spesifik NAD +, residu asam asparagik dari loop pengenalan adenin berada di tempat ke-223 BCENFDH1 dan BSPFDH2, dan berikatan dengan gugus hidroksil OH-3 dari adenine ribosa dari NAD +. Residu ini sangat diawetkan di banyak NAD +ketergantungan FDH dengan lipatan Rossmann, dan memainkan beberapa peran penting dalam spesifisitas NAD +. Artinya, ikatan hidrogen dengan ribosa itu sendiri, dan ikatan hidrogen ke sisi mana pun dari loop pengenalan menetapkan lingkungan yang tersedia dari arginin yang berdekatan, dan potensi gugus asam fosfat yang ditutupi oleh NADP +negatif tolakan. Dalam NAD alami (H) FDH spesifik, mengganti asam asparagat dengan glutamin atau asam amino besar lainnya akan meningkatkan switching antara pengenalan NADP (H) dan komponen hingga 105 kali.
Saat ini tersedia NAD+ Rasio Spesifisitas FDH spesifik (KCAT/KM) NADP+/(KCAT/KM) NAD+ berada dalam kisaran 10 3-10 30. Namun, seperti yang dijelaskan di atas, asam asparagat dari loop pengenalan adeni n-ribose (posisi yang setara dengan tempat k e-223 BSPFDH2 dan BCENFDH1) dapat diubah menjadi glutamin, yang dapat mengubah spesifisitas FDH spesifik NAD +. Misalnya, jika Anda mengubah ASP195 asam asparagat ASP195 dari NAD +enzim tipe liar spesifik CMETFDH-WT menjadi glutamin (ASP195 adalah asam amino CMETFDH yang mendukung BCENFDH1 dan BSPFDH2 GLN223), Enzyme yang dikonservasi dari NAD +NAD +NAD NAD +GLN223), Enzyme yang dikonservasi dari NAD +TOAD +NAD +NAD +GLN223), ENZYME TOAD +TOAD +TOAD NAD +NAD +NAD +NAD +NAD +NAD +NAD +Conserved dari NAD +TOAD +TOAD +TOAD +TOAD +TOAD NAD +NAD +NAD +TOAD NAD +NAAD dari NAD +NAD +NAD NAD +Conserved Conserved Conserved Pergeseran 5000 kali preferensi diamati. Demikian pula, bahkan jika glutamin k e-22 BCENFDH1 (BSP184FDH) dan BSPFDH2 (BSP383FDH) diubah menjadi asam asparagik, pergeseran yang sama dari pemilihan enzim yang sama akan terjadi, tetapi kali ini merupakan preferensi dari NADP +ke NAD +. Dengan cara ini, enzim FDH alami dan enzim spesifik NADH buatan mengenali NADP +, dan prioritas konservatif dialihkan oleh 10 5-twice.
Menurut aspek lain, penemuan ini menyediakan polipeptida FDH yang dioperasikan untuk mengubah bahan kimia yang dipilih antara NADP +dan NAD +. Misalnya, polipeptida FDH dapat dioperasikan untuk lebih memilih NAD +di alam, atau lebih suka NADP +, atau sebaliknya. FDH Polipeptida adalah asam aspartat dalam posisi yang mendukung loop pengenalan adenin-ribosa dari loop pengenalan adenin-ribosa seq ID NO: 1 atau 223 di tempat ke-723 dalam loop pengenalan adenine-ribosa. Preferensi untuk NAD +, dapat dioperasikan sehingga memiliki glutamin pada posisi ini, sehingga dapat dikenali untuk NADP +, dan lebih disukai khusus untuk NADP +. Demikian pula, protein FDH alami memiliki glutamin pada loop pengenalan adenin-ribosa dalam posisi yang sesuai dengan ID SEQ NO: 1 atau 2, sehingga memiliki rasa untuk NADP +, tetapi posisi ini adalah asparagin. , sehingga dapat dikenali untuk NAD +, dan lebih disukai NAD +.
Menurut perwujudan lain, penemuan ini mengontrol kekhasan polipeptida FDH dengan mengendalikan asam amino yang dimasukkan ke dalam loop pengenalan adenin dalam posisi yang sesuai dengan ID SEQ NO: 1 atau 223. Berikan metode untuk dilakukan.
Polipeptida FDH menurut penemuan ini dapat mempunyai spesifisitas kofaktor ganda; polipeptida tersebut dapat digunakan dalam sintesis berbagai produk tingkat industri.
Menurut fase lebih lanjut, penemuan ini menyediakan penggunaan polipeptida menggunakan penemuan ini dalam konversi dari NADP + ke NADPH, atau dalam konversi dari NAD + ke NADH.
Menurut aspek lebih lanjut, penemuan ini memberikan penggunaan polipeptida oleh penemuan ini dalam proses lukisan oksilia.
Menurut fase lain, penemuan ini adalah metode untuk konversi dari NADP + ke NADPH atau konversi dari NAD + ke NADH, asalkan polipeptida FDH dengan penemuan ini, dan menambahkannya ke NADP + atau NAD +. proses yang harus dilakukan.
Menurut perwujudan lain, penemuan ini menyediakan proses ductase oksiida, yang mencakup polipeptida FDH sesuai dengan penemuan ini dan menambahkannya ke campuran reaksi oksid lodactase. Lebih disukai, polipeptida FDH mengubah NADP + dalam campuran reaksi ke NADPH dan NAD + dalam campuran reaksi ke NADH.
Jelas bahwa polipeptida artistik dapat digunakan dalam banyak reaksi reduksi oksida menggunakan NADPH, yang tidak dapat dicapai karena alasan efisiensi, biaya, dan aliran limbah.
Polipeptida sesuai dengan penemuan ini dapat digunakan dalam proses lodactorase oksid untuk meregenerasi NADH atau NADPH. Lebih disukai, polipeptida digunakan untuk meregenerasi NADPH.
Proses oksiida ductase dapat menyebabkan insert oksigen C-H, sisipan oksigen C-C, amino hidridikal atau tereduksi.
Proses lodactus oksid dapat mencakup reaksi mono-oksigen, oksidasi Baeyer-Villiger, reduksi keton atau sintesis asam D-amino.
Lebih khusus lagi, proses laktat oksiida mencakup ikatan C-H yang tidak dapat diaktifkan, misalnya, atom oksigen dalam posisi secara selektif dan tiga dimensi, dan memperoleh 1-fenil-1-propanol. Ini akan berhasil dicapai dengan menggabungkan aksi enzim BSPFDH2 atau NADP +lainnya-FDH spesifik oleh penemuan ini dengan efek enzim dari citochrome-p450-monooxygenase BM-3.2Molekul dikembalikan ke air oleh NADPH, dan atom oksigen lainnya disiapkan untuk memasok substrat. Semua P450 adalah ketergantungan NADPH. NADP +yang dibentuk dengan cara ini dikembalikan ke NADPH dengan aksi FDH menggunakan GAP. Oleh karena itu, konversi atom keseluruhan adalah O.2Pembongkaran ini dipasok dari asam gin, dan NADP +digunakan sebagai “anta r-jemput hidrid”. Katalis kimia yang setara yang secara langsung mengoksidasi ikatan C-H yang aktif hampir tidak diketahui.
Proses saluran oksiida adalah biologis dan biligor yang disintesis oleh lakton murni optik dengan memasukkan atom oksigen ke dalam ikatan C-C dalam zat keberangkatan yang tepat. Secara khusus, ini dapat mengandung oksidasi pembeli-voligar katalitik biologis (B-V) yang mengubah sikloheksanon menjadi caprolacton. Ini dapat dicapai dengan mengikat efek enzim BSPFDH2 atau NADP +lainnya-spesifik FDH dengan efek enzim dari sikloheksanon monoksigenase (CHMO). Oksidasi B-V, pilihan tiga dimensi keton cincin, memungkinkan akses cepat ke Lacton kiral sebagai perantara yang berharga dari sintesis selektif ENANCHIO. Katalis biologis adalah katalis hijau yang menggantikan katalis logam organik, tetapi telah sering dihambat karena membutuhkan regenerasi NADPH.
Sebagai contoh, hidrida tiga dimensi diperkenalkan dengan etil etilat 4-chloro-3-oxobutanat, dan optik d- (S) -4-chloro-3-hydroxibuttanat etil ester diperoleh. Ester ini adalah perantara farmasi kiral yang penting yang digunakan untuk memilih sintesis selektif slagenin B dan C dan penghambat enzim reduksi HMG-CoA. Ini dapat dicapai dengan efek enzim BSPFDH2 atau FDH spesifik NADP + -spesifik oleh efek enzim dari β-ket reduksi enzim (βKR) Kr101 dengan aksi enzim enzim reduksi β-ket (βKR). Reaksi reduksi kimia, posisi selektif, dan giastero yang dipilih dari keton, asam ketoat, kettele ke alkohol kiral melalui βKR dapat memungkinkan sintesis obat utama dari antidepresan ke adrenalin.
Proses laktase oksiida mungkin terlibat dalam sintesis yang disedot dengan ketreeda seperti sintesis asam amino yang tidak alami (varian sintesis degussa tert-leusin). Secara khusus, asam 2-oxyacic adalah amino reduksi selektif tiga dimensi menjadi D-hexylglycine, atau efek enzim FDH spesifik NADP +lainnya dan asam d-amino dehydrogenase (DAADH). . Asam D-amino telah digunakan sebagai komponen utama dari banyak senyawa biologis, seperti antibiotik, perawatan infertil, antikoagulan, dan insektisida. Anpicillin (termasuk D-phenylglycin) saat ini diproduksi pada skala 5. 000 ton atau lebih setahun.
Menurut perwujudan lebih lanjut, penemuan ini menyediakan metode untuk membangun mutan enzim FDH induk, dan di sini induk FDH bukan BSP383FDH, tetapi variabel ini memiliki aktivitas FDH, setidaknya dibandingkan dengan FDH induk. Dan metode ini adalah sebagai berikut:
I) proses membandingkan struktur tiga dimensi enzim FDH induk dan struktur tiga dimensi BSP383FDH; . Proses mengidentifikasi bagian yang dianggap terlibat dalam perbedaan perbedaan dalam proses memodifikasi bagian FDH induk yang diidentifikasi dalam II).
Metode ini juga dapat mencakup proses pengujian FDH mutan yang dibangun di III) untuk mengkonfirmasi bahwa karakteristik yang dipilih sedang berubah. Karakteristik yang dimodifikasi adalah spesifisitas enzim: stabilitas enzim di bawah kondisi yang berbeda seperti pH, suhu atau lingkungan kimia; karakteristik.
FDH induk dapat dimodifikasi dengan loop pengenalan ribosa adenin. Modifikasi ini memiliki efek mengubah spesifikasi koeksistensi FDH induk. Loop pengenalan ribosa adenin lebih disukai terdiri dari asam amino yang kompatibel dengan asam amino BSP383FDH 222 hingga 227. Modifikasi III) dapat membawa FDH induk serupa dengan BSP383FDH di situs modifikasi. Modifikasi ini dapat dicapai dengan menghapus, mengganti atau memasukkan satu atau lebih asam amino dalam polipeptida FDH induk.
Menurut aspek lain, penemuan ini menyediakan penggunaan koordinat tiga dimensi Bsp383FDH untuk menentukan modifikasi yang dilakukan pada enzim induk FDH untuk mengubah satu atau lebih sifat dari FDH induk. Invensi ini juga menyediakan protein termodifikasi yang dibuat sebagai hasil penggunaan koordinat tiga dimensi Bsp383FDH.
FDH induk mungkin Bsp383FDH atau enzim FDH lainnya. Sifat-sifat yang diubah dapat mencakup perubahan spesifisitas enzim, peningkatan termostabilitas enzim, peningkatan stabilitas enzim dalam lingkungan tertentu, seperti pada pH tertentu atau dalam pelarut berair atau tidak berair tertentu kelompok yang terdiri dari peningkatan kristalisasi, peningkatan sifat kinetik enzim, dan peningkatan tingkat dan/atau laju ekspresi protein, misalnya pada E. coli.
Spesifisitas suatu enzim dapat diubah untuk mengubah spesifisitas kofaktor, misalnya dari NAD+ menjadi NADP+ atau dari NADP+ menjadi NAD+. Alternatifnya, spesifisitas enzim dapat diubah ke substrat yang berbeda.
Metode penemuan ini juga dapat digunakan untuk menentukan cara membuat protein fusi yang mengandung enzim FDH induk.
Mereka yang ahli dalam bidang ini akan menghargai bahwa semua fitur pilihan yang dijelaskan dengan mengacu pada hanya beberapa aspek dari penemuan ini dapat diterapkan untuk semua aspek dari penemuan ini.
Penemuan ini akan dijelaskan melalui contoh saja dengan mengacu pada gambar-gambar berikut: Gambar 1(a) dan (b) menunjukkan reaksi dehidrogenasi asam format;
Gambar 2(a) dan (b) menunjukkan aktivitas kinetik dan preferensi koenzim dari berbagai enzim FDH, termasuk BcenFDH1 (42462 Da) dan BspFDH2 (42466 Da);
Gambar 3 (a), (b), (c) menunjukkan dasar struktural tiga dimensi pengenalan koenzi m-FDH oleh BspFDH2 dan Psp101FDH;
Gambar 4(a), (b), (c) dan (d) menunjukkan aplikasi biokatalitik yang menggabungkan regenerasi BspFDH dan NADPH;
Gambar 5(a), (b) dan (c) menunjukkan spektrometri massa BcenFDH1 (Bsp184FDH). Gambar 5(a) adalah kromatogram, Gambar 5(b) adalah spektrum “RAW” keadaan muatan ganda, dan Gambar 5(c) adalah spektrum dekonvolusi MaxEnt;
Gambar 6(a), (b) dan (c) menunjukkan spektrometri massa BspFDH2 (Bsp383FDH). Gambar 6(a) adalah kromatogram, Gambar 6(b) adalah spektrum “RAW” keadaan muatan ganda, dan Gambar 6(c) adalah spektrum dekonvolusi MaxEnt;
Gambar 7 (a), (b), (c), dan (d) adalah NAD +untuk BSP184FDH (A), NADP +, BSP383FDH (C), NAD +, (D), NADP +. Kinetika pada mekanisme coenzy katalitik.
Gbr Ilmu Kekuatan Michaelis Menten dari masin g-masing, yang merupakan katalis dari katalis.
Gambar 9 (a), (b), (c) dan (d) adalah q223d bsp383fdh (a) nadp +, (b) adalah nad +, q223d bsp184fdh (c) adalah nadp +. Dinamika menten tentang pemilihan bahan kimia cokelat di NAD +.
Gambar 10 (a), (b), (c), dan (d) adalah cmetfdh (a) nadp +, (b) adalah nad +, dan; Michaelis Menten Dinamika Ezym e-Seleksi, yang dikatalisis oleh NAD +.
ARA.
Gbr.
Gbr.
Gambar 14-From Konstruksi PET23B-BSP383FDH, analisis SDS-PAGE dari protein BSP383FDH, dan kultur PLYSS GEIANG, termasuk plasmid PET23B-BSP383FDH ditampilkan.
Gbr.
Gbr.
Gambar 17-NADPH Reaksi pemutaran oleh liar dan mutan P450 BM3: Citochrome P450 BM3/BSPFDH2 Kromatografi gas oksidasi ditampilkan.
